表现出是否产酸产气作为鉴定菌种
的依据。是否产酸,可在糖发酵培
养基中加入指示剂溴甲酚紫（其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以
上呈紫色），经培养后根据指示剂
的颜色变化来判断。是否产气，可
在发酵培养基中放入倒置杜氏小管
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微量细菌生化鉴定管
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[方法]
取糖发酵管培养基,此时培养基应呈澄清、紫色，倒立 小管内无气泡，接种细菌后置37℃温箱培养18－24小时， 观察结果。
▪ 是一组试验 ▪ 靛基质试验或称吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V－
P试验（V）和枸橼酸盐利用试验（C）可缩写为IMViC试 验,i是为了发音的需要加入的。 ▪ 常用于革兰阴性的肠道细菌检测中，可区分产气杆菌属 和大肠杆菌属 ▪ 大肠杆菌＋＋－－;产气肠杆菌－－＋＋； 伤寒杆菌-＋－－； 痢疾杆菌-＋－－。
3.内毒素的检测（2人/组，2支鲎试剂，共38支鲎试剂/室）
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实验三
一、内毒素的检测 二、药敏试验 三、肠道杆菌的鉴定
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一、内毒素的检测
▪ 目的
1.掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2.熟悉内毒素实验的意义。
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检测方法
▪ 家兔发热法:比较烦琐,且灵敏度不高;
▪ 鲎实验法：灵敏度高，可检测小于10ng/ml 的内毒素。
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鲎
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horseshoe crab
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原理: 鲎是一种海洋节肢动物,其血液中含有一种有核变形细 胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。
内毒素（LPS）
凝固酶原
凝固酶
激活
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凝固蛋白原 凝固蛋白 （溶解状态） （凝胶状态）
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主要实验材料
1.大肠杆菌,白色葡萄球菌培养物
2.含抗生素的滤纸片: 青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素
3.普通平板，细菌接种工具，培养箱
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方法步骤
1.标记分区; 2.密涂接种； 3.贴药敏纸片； 4.培养； 5.结果观察。
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1.标记分区
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1. 吲哚试验
[原理]
色氨酸几乎存在于所有的蛋白质中,某些细菌含色氨酸 酶，能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质（吲哚）。 后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用，形成红色。
[方法]
将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中， 37℃培养24－48小时取出，在上述细菌的培养液内各加 入寇氏试剂数滴，略加振摇，静止半分钟后观察结果。
阳性
阴性
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[结果]
甲
基
红 试
红色为阳性,+
验
不出现红色为阴性，-
对照
大肠杆菌：+ 产气杆菌：—
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3. V－P试验 葡萄糖
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病 原 菌 的 检 验 程 序
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采集标本
增菌培养
分离培养
革兰染色
革兰染色
接种琼脂斜面纯培养
观 察 菌 落 特
生 化 试 验
血 清 学 试 验
动 物 试 验
征
分析鉴定
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细菌的生化反应
▪ 概念:用生化的方法来检测细菌对各种基质的 代谢作用及代谢产物,借以鉴别细菌种类，这 种生化试验称为细菌的生化反应试验。
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[结果]
❖大肠杆菌为阳性 ❖伤寒杆菌为阴性
阴性 阳性
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2.甲基红试验
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
乙酰甲基甲醇（中性）
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红
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大肠杆菌
pH＞5.4
甲基红试剂
培养基橘黄色
产气杆菌
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[方法]
在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂 数滴,立即观察结果。
1.检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素;
2.临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引 起的内毒素血症（内毒素休克）等。
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二、药 敏 试 验
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目的要求
1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定; 2.了解药敏试验的操作方法和意义。
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原理
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶 解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓 度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长 被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测 试菌对测定药物的敏感程度。
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2.密涂接种
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3.贴药敏纸片
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4.培养
置37℃温箱, 培养18-24h。
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五、 结果
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抑菌圈直径
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操作内容
1.两人1个平板 2.密涂接种大肠杆菌,贴片，标记及培养
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三、肠道杆菌的鉴定
实验材料
1.肠道致病菌的鉴定: 玻片每人2张; 革兰染液； 沙门菌属多价O血清（1套/班）； 双糖铁培养基（2支/组,18支/室）； 大肠，伤寒，痢疾三种细菌在双糖铁培养基上的生长现象 示教（每个教室1组）。
2.药敏实验： 菌液（1个/组，8个/室）。 固体平板（2个平板/组，19个/室）； 药敏纸片（1套/班）。 药敏实验的示教板（1个/室，共8个）。
[结果]
1、确定细菌是否生长
2、产酸,则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+” 表示。
3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气 泡，用“ ”表示。
4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”
表示。
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糖 发 酵 实 验
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（二）IMViC试验
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▪ 材料: 鲎试剂 内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水 无菌无热源质吸管
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方法:（每四人两支鲎试剂,一支实验一支对照）
实 验
对 照
0.1ml溶解水+0.1ml内毒素
0.2ml溶解水
垂直放入37℃温箱,20-30分钟观察结果。
结果: 实验组出现凝固
对照组不出现凝固
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内毒素检测的应用:
▪ 意义：是鉴别细菌的重要依据。
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生 化 反 应
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碳水化合物 代谢试验
糖发酵试验 甲基红试验 V-P试验
碳源和氮源 利用试验
枸橼酸盐利用试验
蛋白质和氨基 酸代谢试验
吲哚试验 硫化氢试验
各种酶类试验： 尿素酶实验 抑菌试验
IMViC试验
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（一）糖发酵试验
[原理]
根据细菌分解利用糖能力的差异