免疫组化在医学中的应用
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(或免疫细胞化学技术
免疫组化技术是用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原作定性、定量、定位检测的技术。

现广泛应用的有酶免疫组化、免疫金银组化、免疫电镜技术等。

免疫组化的分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

免疫组化实验所用的组织和细胞标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

免疫组化实验所用的抗体
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。

多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

免疫组化常用的染色方法
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。

这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

免疫组化操作步骤
免疫组化（LP 法）操作步骤：
1．切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行
2. 缓冲液洗3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色, 将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10-15 分钟。

4. 缓冲液洗5min/2 次。

5. 滴加Ultra V Block ，在室温下孵育5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过10 分钟，否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有 5 －10% 正常羊血清，这一步可以省略。

）
6. 缓冲液洗5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液37 ℃孵育1 －2 小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）
8. 缓冲液洗5min/2 次。

9 ．滴加Primary Antibody Enhancer( 增强子) , 在室温下孵育20 分钟。

10 ．缓冲液洗5min/2 次。

11 ．滴加HRP Polymer( 酶标二抗) ，在室温下孵育30 分钟。

（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）
12 ．缓冲液洗5min/2 次。

13 ．向1ml DAB Plus Substrate ( 或AEC Plus Substrate) 中滴加1-2 滴DAB Plus Chromogen （或AEC Plus chromogen）, 混匀后滴加到切片上，孵育3 －15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。

）
14 ．自来水充分冲洗, 复染，脱水, 透明, 封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤：
冰冻切片4-8um ，室温放置30 分钟后，入4 ℃丙酮固定10分钟，PBS 洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

免疫组化实验结果的判定和分析
从实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求，这点对于形式为腹水，上清，培养液之类的抗体显得更为重要。

关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确，一般而言，客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析，例如是简要还是详细的描述实验结果，需要实验数据否，图片的数量与规格等。

如果为双盲试验或有第三方参与，则事先申明。

免疫组化在临床工作的意义
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。

在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.
染色难以作出明确的形态学诊断。

尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。

免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：
(1)恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；
(2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位；
(3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型；
（4）软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；
（5）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。

（6）为临床提供治疗方案的选择。

例如恶性间皮瘤，它是一种较少见的肿瘤，主要发生于浆膜腔，由于其形态学复杂，较易与其他肿瘤，尤其是肺癌及浆膜腔转移性腺癌相混淆。

近年来，由于新抗体的不断出现和免疫组化技术的发展，对恶性间皮瘤的诊断和鉴别诊断有了新的认识。

早期应用的肿瘤标记物多为腺癌阳性表达，而间皮瘤阴性表
达，用“反证法”加以诊断，如CEA，Leu-M1,B72.3，Ber-EP4等。

新近出现的几种抗体多为间皮瘤的特异性抗体，即间皮瘤多为阳性表达，而腺癌多为阴性表达，在二者的诊断与鉴别诊断上具有一定的应用价值，
是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(或免疫细胞化学技术)，此外，免疫组化在女性子宫癌症等多种疾病中均有广泛应用。