TwinCubator® （可做12个条）
杂交仪（自动,20条）
GT-Blot® 20
杂交仪（自动,48条）
GT-Blot® 48
结果判断

野生型：有杂交带显色为“+”，表示未发生突变 耐药突变位点：有杂交带显色为“+”，表示发生 突变
60°C
AE
探针
杂交体
选择
AE
AE
选择性试剂
AE AE AE
60°C
AE
AE
AE
结果测定
注射 1
注射 2
显示
打印机
PMT
Photo multiplicator
CPU
微机处理器
化学发光读数仪 / 原理
键盘
ATA TRAINING / TP / Nov 97
19
MTD结核分枝杆菌的直接检测意义

TB与其他分枝杆菌区分
结核菌快速测定
Genprob Leader-50i
方法

方法名称：
HPV（Hybridization Protection Assay）-杂交保护分 析法为Gen-probe公司专利

检测设备：
LEADER 50i
不同方法结核菌检测报告时间

罗氏（LJ）培养: 2-8 周 HPA-MTD: 2.5h 报告
A T A T
A T
C
RNA 聚合酶
C G T A
G C
T A
A T C G T A G C G C A T AT
A T G C G C T A
G C
DNA 10 000 套 r-RNA (eg : E.coli)
样本前处理
细胞溶解 样本
目标 r-RNA释放
杂交
rRNA
AEBiblioteka AE15分钟AE
AE AE AE AE
结核分枝杆菌（TB）分子生物学检测
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)， 俗称结核杆菌，是引起结核病 的病原菌。可侵犯全身各器官，但 以肺结核为最多见。 结核病至今仍为重要的传染病。 估计世界人口中1/3感染结核分枝 杆菌。据WHO报道，每年约有800 万新病例发生，至少有300万人死 于该病。 我国建国前死亡率达200-300 人/10万，居各种疾病死亡原因之 首，建国后人民生活水平提高，卫 生状态改善，特别是开展了群防群 治，儿童普遍接种卡介苗，结核病 的发病率和死亡率大为降低。但应 注意，世界上有些地区因艾滋病、 吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和 贫困等原因，发病率又有上升趋势。
严格的实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本 全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染。
GenoType® MTBDRplus 结核菌药敏试验
基本原理
采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip） 检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟 肼(katG和inhA)等结核治疗药物的耐药基因来 判断TB体内耐药性
TB形态
全球感染情况
实验诊断检测方法

常规检测方法 分子生物学检测方法
常规检测方法
一个月
二个月
三个月
分子生物学检测（PCR）方法
回顾RNA与DNA
RNA Vs DNA


RNA-核糖核酸 – 只存在於活细胞 – 非常脆弱，环境中存在水解酶（RNase） – 单链结构������ ������ ������ ������ DNA-脱氧核糖核酸 – 非常稳定，在死亡生物内也可存在 – 双链结构
药物 异烟肼 基因 katG inhA 利福平 吡嗪酰胺 链霉素 乙胺丁醇 rpoB pncA rpsL rrs embB 功能 Catalase-Peroxidase Enoyl-ACP-Reduktase ß-Subunit of RNAPolymerase Pyrazinamidase ribosomal Protein S12 16S rRNA Arabinosyl-Transferase DNA-Gyrase A 耐药百分比 40 - 100 % appr. 25 % appr. 10 % > 90 % appr. 95 % appr. 60 % appr. 20 % appr. 60 % appr.80-90%
采用分子技术快速鉴定（2.5小时）结核分枝杆菌复合群；



标本可以是涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物。
唯一获得FDA推荐的凃阴样本快速检测技术 检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病 人）


采用TMA恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实 验室认证 HPA杂交保护分析技术：灵敏、特异
PCR扩增
不同标本,扩增参数不同

培养菌种：扩增20个循环
涂阳标本：扩增30个循环
扩增产物：
扩增过程标记生物素
(Bio-11-dUTP、Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP ?)
杂交
采用反向杂交方法
•PCR扩增产物→变性
（DNA成单链）→与探
针杂交→洗涤→显色→ 判断结果
杂交试剂
杂交仪（手工,12条）
直接从标本中检测结核菌

HPA-Accuprobe: <1h 报告
用菌落或自动培养系统的菌液
HPA-MTD方法检测TB
优势（一）靶分子选取
核糖体RNA- RIBOSOMAL RNA
rRNA作为靶分子好处：
–
–
生物扩增提高灵敏度
靶位独特的核酸次序保证检测特异性
靶分子 : rRNA
优势（二）敏 感 度
ahpC-Promoter Alkyl-Hydroxid-Peroxidase
Chinolone 氟喹诺酮 gyrA
检测过程

DNA提取 PCR扩增 探针杂交
结果判断
DNA提取

1.
标本
固体或液体培养基培养的菌 种 抗酸染色涂片阳性标本
2.

1. 2.
方法
超声波裂解： GenoLyse试剂盒：
GenoType® MTBDRplus检测举例 异烟肼：katG和inhA基因 katG基因：编码触酶-过氧化物酶 40-100%异烟肼耐药是由该基因突变引起且 为高水平耐药 inhA基因：编码NADH烯酰基ACP还原酶 25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水 平耐药
分枝杆菌复合群中的耐药基因
AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）

TB耐药基因
发现并监测耐药菌株，为医生提供有效治疗TB复燃方案
提高TB检出率
CSF、胸腹水等
疑似患者
长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、 痰TB菌PCR
Gen-Probe结核分枝杆菌检测分析仪特点