一 样品预处理 (一)常规样品
1.取材 5×8 mm， 保护观察面
2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗，快！
3.固定、脱水 同超薄切片
(二) 游离细胞 收集所需细胞
适量0.1%多聚赖氨酸
PBS洗涤，1000rpm 5min,弃上清
4×6 mm玻片,室温5-10min
滴入2-4ml 0.5%戊二醛，4oC 0.5h
用滤纸吸去载网边缘多余液体 载网未完全干
滴染色液，染色3-5min
用滤纸吸去载网边缘多余液体，自然干燥，镜检 (三) 影响因素
1.被检样品纯度和浓度 2.染色液pH 3.操作技巧
扫描电镜生理、导电 含水量多的组织(大多数组织) 预处理、 干燥、 导电
负染技术 阴性反差染色，染色剂不被样品吸收而是沉淀
到样品四周。用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞 成份的检测。
（一）染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小
2-4%磷钨酸，pH6.4-7.0； 2-3%醋酸铀，pH4.2
（二）操作方法 待检生物组织悬液滴于载网，静置5-10 min
样品以液氮快速冷冻 移至真空 冰升华为汽 费时 低温损伤
3.坎烯干燥法
升华介质——坎烯 45oC以下为固态，室温中可升华
标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min
纯坎烯45oC 20min
室温，坎烯变为固体，
放入真空、升华
4.乙腈干燥法
标本预处理
50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min (用乙醇配制)
吸去多余液体,成膜
PBS洗涤，1000 rpm 5min,弃上清，制成悬液
膜未干
细胞悬液滴于玻片，5-30min滤纸吸去多余液体
1%戊二醛，4oC 1h
PBS漂洗，1%OsO4，4oC 1h，梯度酒精脱水
（三）欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部
用“割断法”暴露观察部位
1.常用的割断法
二甲基亚砜(DMSO)割断法 环氧树脂割断法
立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华
5.临界点干燥法 干燥效果最好，应用最广泛 ⑴原理
物质三相(固、液、气)相互转化，可单相存在，也 可复相存在。
临界状态：物质在特定温度(临界温度)时，表面 张力系数为零，物质不以液态存在，变成气体。
液态CO2临界温度：31.5oC，临界压力72.8kg/cm2
⑵方法
样品固定、脱水 中间液(醋酸异戊酯)置换
样品置入预冷的样品室 注入液态CO2
CO2置换 临界处理 放气取样
三 生物样品的导电 (一)目的
避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响 (二)方法
1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面(100-
200Å ) 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率(≤100Å )； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
2.冷冻割断的操作
TF-1冷冻割断仪
简易割断器
注入液氮
固化包埋
割断
溶化冲洗
3.标本制作法
取 材 (1×1×5mm) 、 前 固 定 (1%OsO4 ， 4oC 1h) 浸 洗 (0.1M PBS ， 10min×3次 )
DMSO浸泡(12.5%、25%、50%各30min)
冷冻割断
后固定(0。1%OsO4，4oC 30min)
2.离子溅射法/离子镀膜法
优点：①热辐射小 ②颗粒细、喷溅均匀 ③金属消耗少 3.导电染色法/组织导电技术(TOT)
利用金属盐(碘化甲、单宁酸)对生物体蛋白质、脂肪 的结合作用
扫描电镜生物样品制备的基本程序
双 蒸 水 洗 涤 30min ， 2% 单 宁 酸 15min×2 次 ， 双 蒸 水 洗 涤 30min 1%OsO4，4oC 30min， 双蒸水洗涤30min 梯度酒精脱水
二 生物样品的干燥 除去脱水剂使组织真正干燥，克服表面张力的影响， 保存样品表面微细结构 1.自然干燥法
无法避免表面张力的影响，仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法