1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化
免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。
可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完 全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫 （量减半，改用不完全佐剂，可反复多 次)冲击免疫（融合前3天进行）
抗体的人源化技术进展:
• 单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。 • 单抗将发展成为一大类独立医药产品。 • 鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代: 原因：1.鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，
2.CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱； 3.与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱； 4.鼠源抗体半衰期短，发挥ADCC与CDC作用的时间较短； 5.鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。
鼠抗体人源化的构建方法:
嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体
恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度 达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性 ，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了30%的鼠源性，可诱发人抗 小鼠反应HAMA。
表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅
替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选 用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换:互补决定区（CDR）构象的残基尽量不 替换。
重构抗体：由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包
括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移。
转染色体牛:
产生人Ig 转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人Ig 轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步 发育成转染色体牛。
产生人Ig 转染色体牛的构建特点在于：
(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系， 因此将人人工染色体导入牛胚胎成 纤维细胞；
(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；
抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达 抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针 对任何抗原的单克隆抗体。
单克隆抗体药物概况
单克隆抗体（MAB）是近年来复合年增长率最大的
一蛋白类药物，2001年全球销售额增长了57.3%，接 近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗 药物方面。预计到2010年用于癌症治疗的单克隆抗体 将占其销售总额的54.7%。据预测，单克隆抗体将会 以复合年增长率16.3%的速度增长，到2010年达到 121.39亿美元的市场规模。其中，治疗癌症的单克隆 抗体市场规模将达66.36亿美元。
单克隆抗体制备平台建立
尹芝南 美国耶鲁大学医学院副教授 南开大学生命科学学院院长
基本概念
抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体
Antigenic determinant
是指抗原分子中决定抗原特异性的 特殊化学基团，又称表位(epitope).
细胞克隆： 由一个细胞增殖而成的细胞集团
全人源化抗体
完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库 筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。
2.1 抗体库筛选技术:
抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基
因；PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、V基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先导系列的紧靠下游，使 外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、 简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。
转基因小鼠：将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基
因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单 抗技术。不足之处：(1)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导 致不十分完全的人序列；(2)由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单 抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；(3)转基因小鼠 表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。
克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显 微克隆法
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、 变异及污染
单抗生产的方法：
动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸 或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞， 7-10天后出现腹水，无菌采集。
单抗纯化方法：
盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法
基因工程小鼠制备全人抗体
全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠 （hu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。
Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周 血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人 源抗体。
Ab4
Ab3
Ab2
普通抗血清（多克隆抗体） Ab4
骨髓瘤小鼠
脾
取腹水
B 细
骨髓瘤细胞
胞
+ PEG, 融合
杂交瘤细胞
HAT培养， 稀释
Ab1
单克隆A抗b3体 Ab4
杂交瘤技术的理论基础
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体
细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性
转染色体小鼠：通过微细胞介导法（MMCT方法）将人14号染 色体上产生IgH 的胚系片段和2号染色体上5～50 Mb 的κ轻 链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后， 可产生抗人血清白蛋白的人Ig，再次免疫后IgM产生。由转染 色体技术得到的小鼠，表达的人IgG各亚类的量与人血清中表 达的IgG各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但 是，转染色体小鼠导入的人Ig 片断虽然比较大，但其表达的 人Ig量却比较低。
单克隆抗体特性
理化性状高度均一，生物活性专一，只 与一种抗原表位发生反应，特异性强， 纯度高，易于实验标准化和大量制备
单克隆抗体在医学中的应用
检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人HAC 的微细胞与牛胚 胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d，因此必须经过2 次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多 抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一 定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。
Thanks
Thanks for attention
Dec.5.2007
摄于新疆喀纳斯湖2005.8.18
骨髓瘤细胞系选择要点：
稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、 HGPRT缺陷株
常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清）
融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好 的形态，活细胞计数高于95％
融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环 节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、 克隆化和扩大培养过程中
脾

抗原免疫的脾细胞(B细胞) 小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)
1.抗体分秘(IgG+)
1.具永生性
2.HGPRT+在HAT生长
2. 8AG筛选出HGPTP-株


PEG 融合 HAT筛选

脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）

（HGPRT+、Ig+）
融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞
饲养细胞一般在融合前一天制备
免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。
融合比例：
骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10
融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）
融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液2周后,改用一般培养液
基因工程抗体与抗体库技术
单抗体内应用和疗效受限原因： 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量
甚少 3.生产成本高,难于普及应用
人杂交瘤技术未获真正突破原因:
融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不 能随意免疫
基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良 的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的 鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体
Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞 克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源 抗体
单 克 隆 抗 体 和 多 克 隆 抗 体 产 生 区 别Ab1 Ab3
抗血清
选用6-12周龄Balb/c小鼠
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很 好的免疫效果
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。