在以上实验中，研究人员使用新产品In-Fusion Advantage和原始In-Fusion PCR Cloning克隆2kb PCR产物到pAcGFP（Kpn I线性化）。为研究PCR添加剂对每种克隆系统的影响，所有PCR反 应中加入DMSO和半数反应加入GC-Melt Reagent。扩增后，PCR产物经过柱纯化或Cloning Enhancer处理，克隆到线性化载体。进行In-Fusion反应，最后转化到Fusion-Blue感受态细胞。 只需将产物的 1/10涂布平板。每种系统产生的平均克隆数如表中所示。一般In-Fusion Advantage PCR Cloning System所得到的克隆数是原始In-Fusion PCR Cloning System的3–4 倍。 当使用In-Fusion时克隆效率不受 时克隆效率不受PCR缓冲液的影响。 缓冲液的影响。 当使用 时克隆效率不受 缓冲液的影响 In-Fusion Advantage PCR Cloning的克隆数是原始 In-Fusion PCR Cloning Kits的3-4 倍。 的克隆数是原始 的
Advantage w/CE
InIn-Fusion Enzyme 5x Reaction Buffer Control Vector Control Insert Cloning Enhancer 规格： 规格：10, 50, 100
Advantage
w/NucleoSpin InIn-Fusion Enzyme 5x Reaction Buffer Control Vector Control Insert NucleoSpin Extract II 规格： 规格：10, 50, 100
2007 Clontech Laboratories, Inc.
In-FusionTM PCR克隆的特点 克隆的特点
In-Fusion PCR 克隆的优点： 克隆的优点：
灵活 高效 便捷 无缝连接 定向克隆
适用任何载体和插入片段 阳性克隆效率>90% 不受载体限制 节省筛选克隆试剂
PCR产物无需限制性内切酶处理、 节省处理PCR产物的时间和试剂 纯化或连接 无附加多余碱基序列,获得预期 结果 插入片段以正确方向克隆 载体自由选择 节省筛选克隆的时间和试剂 节省亚克隆的时间和试剂
试剂盒规格
2007 Clontech Laboratories, Inc.
In-Fusion Advantage PCR克隆特性检测 克隆特性检测
不同实验条件下In-Fusion Advantage PCR 克隆效率比InFusion Liquid PCR Cloning Kits 高 3-4倍：
载体 插入片段
确保完全切开或PCR扩增，降低背景反应 插入片段经纯化或Cloning Enhancer处理 使用过量插入片段导致克隆数少
感受态细胞 用于转化的感受态细胞效率 >108 cfu/g 引物 In-Fusion 反应 转化
2007 Clontech Laboratories, Inc.
In-Fusion PCR 克隆的长远策略是使克隆更简便 Clontech推出完整试剂盒： 包含 Cloning Enhancer或NucleoSpin，促销/ 附加PCR酶 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kits给客户提供优化的方法纯化PCR产物
2007 Clontech Laboratories, Inc.
正确引物的设计和合成 载体和/或插入片段的使用量的确定 执行推荐的孵育条件：37oC 15’分钟，50oC 15分钟 转化前需要稀释 In-Fusion克隆反应产物 转化一小部分稀释的 In-Fusion克隆反应产物
In-Fusion
TM
Advantage 总结
In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kits 实现更完美的In-Fusion克隆 实现更完美的 克隆 改进酶的形式： 改进酶的形式：
了解In-Fusion Advantage请登陆/infusion
2007 Clontech Laboratories, Inc.
总结
In-Fusion系统与其它克隆系统相比具有以下优点：大 片段克隆、使用载体克隆（如腺病毒载体）、多片段 同时克隆和高通量克隆等等。 优化的In-Fusion Advantage PCR Cloning kits 克隆效 率更高，产品种类多。新酶更稳定、更强大。 In-Fusion系统定位比其它公司产品好的原因：
2007 Clontech Labontage: 高效克隆的强大系统
每种克隆系统获得的平均克隆数
实验条件 柱纯化PCR 产物 添加DMSO 柱纯化PCR 产物 添加 DMSO & GC-Melt Reagent Cloning Enhancer处理PCR产物 添加 DMSO Cloning Enhancer处理PCR产物 添加 DMSO & GC-Melt Reagent 新产品 In-Fusion Advantage ~1358 598 706 391 原始 In-Fusion 218 180 268 163
细胞类型
Top 10 DH 10B XL-1 Blue JM 109
In-FusionTM Advantage 兼容细胞类型广。对于一些细胞系In-Fusion cloning反应时需要10x稀释
2007 Clontech Laboratories, Inc.
In-Fusion克隆成功的要素？ 克隆成功的要素？ 克隆成功的要素
不同的插入片段：2kb, 8.5kb 和 12 kb。 同源区域富含GC。 几种PCR片段克隆到相同载体。 不同量的PCR产物和载体/插入片段的不同分子比（10 ng-100 ng； 1/0.4 -1/4。 不同形式的线性化载体：单一酶切、 双酶切、 PCR 扩增、 粘性末端、 3’ 和5’ 突出。 使用不同E.coli感受态细胞的不同稀释度转化。 使用PCR 添加剂如DMSO和GC-Melt Reagent。
与In-FusionTM Liquid and In-Fusion Dry Down Kits相比，InFusionTM Advantage 具有更高的克隆效率和更强大的性能。 In-FusionTM Advantage Kits 具有便捷的产品形式(10 rxn)。
2007 Clontech Laboratories, Inc.
In-Fusion Advantage PCR Cloning Kits:
产品概述 产品选择及参考文献
In-FusionTM PCR Cloning操作手册概述 操作手册概述
In-Fusion PCR 克隆：快速、简便和高效地 克隆：快速、 克隆PCR扩增的DNA PCR扩增的DNA片段 克隆PCR扩增的DNA片段
In-FusionTM 产品的选择
New Product Description Format Liquid Liquid Liquid Liquid Liquid Liquid Liquid Liquid Liquid Dry Down Dry Down Dry Down Dry Down In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer In-Fusion Dry-Down PCR Cloning w/Cloning Enhancer and Competent Cells Dry Down Dry Down Dry Down Size , RXN 10 50 100 10 50 100 10 50 100 8 24 96 24 24 96 8 Yes Yes Yes Yes Spin Cells CE Columns Included Included Included Cat# 639619 639620 639621 639616 639617 639618 639622 639623 639624 639602 639604 639605 639606 639607 639608 639609
In-FusionTM Advantage概述 概述
特征 酶的形式 酶的活性 In-Fusion PCR 克隆 10X 反应前需要稀释 严格按照操作手册进行实验 效率可能会受到PCR缓冲液的影响 依据细胞类型得到不同的实验结果 酶的稳定性 10X 酶-70oC保存1 年 1X 酶-20oC保存5个月 克隆效率 平均克隆数比In-Fusion Advantage少 3-4倍 阳性克隆效率>90% 没有便捷的产品包装 50 rxn 100 rxn 平均克隆数比In-Fusion多3-4倍 阳性克隆效率>90% 10 rxn 50 rxn 100 rxn 所有规格的都有配备Cloning Enhancer 或NucleoSpin和不配备 Cloning Enhancer 或NucleoSpin 的产品形式 In-Fusion Advantage PCR 克隆 直接使用的1X 无需稀释 操作手册的细微变化不影响实验 不受PCR缓冲液的影响 兼容的E. Coli 细胞类型广 1X 酶-20oC保存 1 年
In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit
In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer
Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/NucleoSpin In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit w/Competent cells In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit
一次克隆获得预 无需亚克隆 期结果
最终产品满足实验者的需要
具有高通量产品