1999205214收到,2000204224接受。
国家自然科学基金资助课题。
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缩写 BAPNA :苯甲酰精氨酸对硝基苯胺;CHM :亚胺环己酮;PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS:十二烷基磺酸钠;SSP:盐溶蛋白。
去胚轴对花生子叶肽链内切酶和贮藏蛋白质降解的影响宾金华13 傅家瑞2(1华南师范大学生物系,广州510631;2中山大学生物系,广州510275)摘要:从离体子叶与连体子叶在水中培养一段时间后的比较,看到它们之间在肽链内切酶活性和盐溶蛋白及花生球蛋白降解上的差异并不大,这表明去除胚轴对子叶肽链内切酶活性和贮藏蛋白降解的影响很轻微。
亚胺环己酮(蛋白质合成抑制剂)不能完全抑制离体子叶肽链内切酶活性的提高,子叶的大部分大分子贮藏蛋白同样被降解。
这表明,在花生种子萌发过程中降解大部分贮藏蛋白的子叶肽链内切酶并非全部是在种子萌发时新合成的,子叶贮藏蛋白降解和肽链内切酶活性基本不受胚轴调控,子叶与胚轴之间在调控关系上可能是一种新的调节类型。
关键词:花生,离体子叶,肽链内切酶,贮藏蛋白降解,亚胺环己酮学科分类号:Q945 肽链内切酶在萌发种子的贮藏蛋白质降解中起重要作用,且与种子活力密切相关(Chrispeel 和Boulter 1975,Nielsen 和Liener 1984,宾金华和傅家瑞1995,黄上志和傅家瑞1992)。
它的合成及活性调节一直受到人们重视。
双子叶的豆科植物和单子叶的禾本科植物中,多数为萌发后新合成,且前者与胚轴有密切关系,后者与胚分泌激素密切相关(Bewley 和Black 1985,Dunaevsky 和Belozer 2sky 1993,K oehler 和Ho1990,Shintani 等1997,Shutov 和Vaintraub 1987)。
在花生子叶中此酶的合成和活性调节方式了解极少,以整粒花生种子为材料,我们已证明花生子叶肽链内切酶不是在种子萌发过程中新合成的(宾金华等1996a )。
本试验用花生离体子叶为材料,拟进一步证明此酶的来源和活性调节方式。
1 材料与方法1.1 植物材料供试花生(A rachis hypogaea L.)为粤油2116品种,由广东省农业科学研究院作物研究所提供。
选取中等大小种子,用1%次氯酸钠消毒5min ,蒸馏水冲洗6次后剥取子叶,将子叶置于垫有两层滤纸的培养皿中,加入适量蒸馏水后置黑暗中培养(28±1)℃。
每一处理为20粒种子,每粒种子的两片子叶分别培养,按规定天数取出子叶保存于-80℃中备用。
一片子叶用于酶活性测定,另一片子叶用于贮藏蛋白质测定。
亚胺环己酮(cyclohex 2imide ,CHM )为Sigma 产品,用蒸馏水配制成所需浓度,加入培养皿中培养子叶,培养条件和操作步骤均同上。
1.2 蛋白质提取和测定蛋白质提取按照Yamada 等(1980)及黄上志和傅家瑞(1992)的方法进行。
蛋白质含量测定按Bradford (1976)的方法进行,以牛血清蛋白作标准曲线。
SDS 2PA GE 按照Laemmi (1970)及黄上志和傅家瑞(1992)的方法进行。
1.3 肽链内切酶提取和活性测定取子叶按1∶5(W /V )加入预冷含β2巯基乙醇10μmol/L 的磷酸缓冲液(p H 7.2,20mmol/L ),在冰浴中研磨成匀浆,4℃下浸提4h 后离心20min (15000×g ,4℃)。
在上清液中加入硫酸铵使饱和度达80%,静置2h 后再离心(15000×g ,4℃,20min ),所得蛋白质沉淀溶于含β2巯基乙醇10μmol/L 的醋酸缓冲液(50mmol/L ,p H 5.4),并在4℃中对该液透析24h 。
经透析后的酶溶液离心(15000×g ,4℃,20min )除去不溶物,所得上清液即为酶提取液。
以BAPNA 为底物测定肽链内切酶活性,参照Harris 和Chrispel (1975)的方法,以波长410nm 下的OD 值每分钟每0.01为1个酶活性单位。
电泳后检测肽链内切酶活性则按Jammel 等(1984)方法进行,但分离胶改为7.5%,明胶底物终浓度为0.8%。
2 结果2.1 离体子叶肽链内切酶活性变化564植物生理学报,Acta Phytophysiologica Sinica 2000,26(6):465～470花生离体子叶水中培养过程中肽链内切酶活性在培养4d 后即明显低于正常萌发种子子叶(连体子叶)的酶活性,但其活性变化趋势与连体子叶的酶活性变化趋势一致(都有一陡增的过程)(图1)。
经t 检验统计分析,培养4d 后离体子叶和连体子叶两者的酶活性间存在显著差异(t =3.26>t 0.05=3.18,df =3,即p <0.05)。
培养在CHM 1mmol/L 的离体子叶,其肽链内切酶活性明显低于培养在水中离体子叶的酶活性,此时酶活在培养0～2d 期间发展的曲线较平缓,酶活性逐渐降低,2d 后逐渐增加,没有陡增的现象(图1)。
图1 培养过程中花生离体子叶肽链内切酶活性发展的时间进程Fig.1 The time course of endopeptidase activity in peanut cotyledons cultured in water or CHM 1mmol/L●:Attached cotyledon germinated in water ,○:Detached cotyledon cultured in water ,▲:Detached cotyledon cultured in 1mmol/L CHM. 离体子叶在系列浓度CHM 溶液中培养6d ,肽链内切酶活性被不同程度降低(图2)。
以水培养的肽链内切酶活性作为对照(100%),计算不同浓度CHM 溶液使花生离体子叶酶活性下降的百分率以表示抑制程度,并作图(图3),可以看到,CHM 的抑制曲线呈Michaelis 2Menten 方程,其K m值约为0.12mmol/L 。
电泳后检测酶活性,正常花生种子萌发子叶的第一条酶带在萌发0.5d 出现,第二条酶带在萌发第2天出现(宾金华和傅家瑞1995)。
本实验中,离体子叶肽链内切酶的第一条酶带在培养第2天出现,第二条酶带在培养第3天出现(图4A );我们同时还检测萌发1和2d后去胚轴对子叶肽链图2 花生离体子叶培养在不同浓度CHM 溶液或水中6d 的肽链内切酶活性和花生球蛋白含量Fig.2 The endopeptidase activity and arachin content in de 2tached peanut cotyledons cultured in 1mmol/L CHM or water for 6days图3 不同浓度CHM 溶液培养花生离体子叶6d 对肽链内切酶活性降低的程度Fig.3 The depression of endopeptidase activity of detached cotyledons cultured in different CHM solution for 6days内切酶同工酶带出现时间的影响,看到前者与培养离体子叶的情况相同,而后者与正常萌发相比已无影响(结果未列出)。
可见,萌发较短时间(0～1d )去除胚轴延缓了花生子叶肽链内切酶同工酶带在凝胶图上出现,萌发较长时间(2d )去除胚轴则已无影响。
同样检测培养在不同浓度CHM 溶液6d 子叶的肽链内切酶活性,酶活性随CHM 浓度增加而逐渐降低(图4B )。
664植 物 生 理 学 报 26卷图4 花生离体子叶肽链内切酶的凝胶图谱F ig.4 S DS 2P AG E pattern of end opeptidae activ ity in detached peanut c oty led ons cu ltured in water (A )and cu ltured in d ifferent CH M s olution (B )2.2 离体子叶贮藏蛋白质的降解花生种子的贮藏蛋白通常用含NaCl 0.1mol/L 的磷酸缓冲液提取,因而又称盐溶蛋白,它们主要有花生球蛋白(分子量为19.5～40.5kD ,占73%)、伴花生球蛋白Ⅰ(60.5kD ,占6%)、伴花生球蛋白Ⅱ(17kD ,占21%,也常称2s 蛋白)(图6,0d )。
多数双子叶种子在其胚轴被去除后,其子叶贮藏蛋白在萌发中的降解速率和程度都明显降低。
花生离体子叶盐溶蛋白的降解速率仅略低于正常萌发种子子叶中的,特别是培养2d 后(图5);离图5 培养过程中花生离体子叶盐溶蛋白(SSP )降解的时间进程Fig.5 The time courses of salt soluble protein (SSP )degra 2dation in detached peanut cotyledons cultured in water●:Attached cotyled on germinated in water ,○:Detached cotyled on cu ltured in water ,▲:D etached c oty led on cu ltured in 1mm ol/L CH M.体子叶花生球蛋白的降解也基本一样(图6)。
表明胚轴对子叶中贮藏蛋白降解没有决定性的作用。
离体子叶在1mmol/L 的CHM 溶液中培养,在培养初期,盐溶蛋白(图5)和花生球蛋白(图6)的降解明显减缓;但培养10d ,其盐溶蛋白和花生球蛋白的降解接近离体子叶(图5,6)。
在系列浓度CHM 溶液培养6d 的子叶,其花生球蛋白含量与CHM图6 培养过程中花生离体子叶花生球蛋白降解的时间进程Fig.6 The time course of arachin degradation in detached peanut cotyledons cultured in water or CHM 1mmol/L●:Attached cotyledon germinated in water ,○:Detached cotyledon cultured in water ,▲:Detached cotyledon cultured in CHM 1mmol/L.7646期 宾金华等:去胚轴对花生子叶肽链内切酶和贮藏蛋白质降解的影响浓度相关,高浓度CHM 明显降低花生球蛋白降解(图2)。
SDS 2PA GE 检测离体子叶贮藏蛋白降解,看到大分子贮藏蛋白在培养2d 已降解,培养6d 后贮藏蛋白已基本被降解(图7),与黄上志和傅家瑞(1992)报告的正常萌发花生种子子叶贮藏蛋白降解模式基本一致;与对照(水中培养0d )子叶的贮藏蛋白带相比,1mmol/L 的CHM 培养8～10d 子叶的60.5kD 贮藏蛋白基本已降价,40.5和38.5kD 带隐约可见,18kD 和2s 球蛋白带明显可见(图7),这表明大部分大分子贮藏蛋白已被降解。