实验二酵母菌的死活染色及放线菌的形态观察
赵奕玲 121180169
一．实验目的
1.观察酵母菌的形态及出芽生殖。

2掌握酵母菌的死活细胞的鉴定方法。

3.掌握观察放线菌形态的基本方法，并观察放线菌的形态特征。

二．实验原理
1.酵母菌形态及出芽方式观察的基本原理：酵母菌的死活染色通过用美蓝染色制成水浸片，来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

2.酵母菌子囊孢子观察的基本原理：子囊类酵母菌是以接合产生形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。

它们一般通过邻近的两个形态相同而性别不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起相互接触、局部融合并形成一条通道，再通过质、核配和减数分裂形成4或8个子核，然后它们各自与周围的原生质结合在一起，再在其表面形成一层孢子壁，这些一个个子囊孢子就成熟了，而原有的营养细胞则成了子囊。

能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。

酵母菌形成子囊孢子需一定条件，其中麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。

孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。

因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。

在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。

3.放线菌形态观察的基本原理：放线菌在固体培养基上呈辐射状生长而得名。

放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。

菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。

有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。

孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。

气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。

三．实验器材
1、菌种：酿酒酵母固体培养物，放线菌固体培养物
2、溶液和试剂： a) 0.01%美蓝水溶液，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水等。

b) 香柏油、二甲苯
3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等
四．实验步骤
1.酵母菌的死活染色：
a)涂片在洁净盖玻片中部滴一滴0.01%美蓝水溶液，按常规方法接种酵母
b) 加盖玻片加盖玻片时首先使盖玻片的一端接触载玻片上的液滴的一端，然后再将另一端缓缓放下，目的是防止气泡的产生，以免影响观察；
c) 放置及镜检从接种开始计时，放置3min，然后在高倍镜（×40）下观察酵母菌的形态，根据染色状态判断酵母菌的死活（由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。

死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色），寻找并观察酵母菌不同类型的出芽方式（一端出芽或两端出芽）。

将酵母菌美兰浸片放置30min，再用高倍镜（×40）观察，根据染色状态判断酵母菌的死活，并与3min时的情况做一对比说明。

2.放线菌的形态观察：
用镊子小心取出用插片法培养的放线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。

然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。

找出3类菌丝及其分生孢子。

五．实验结果
1.吕氏碱性美兰染液作用3分钟时，90%以上的酵母菌都存活，30分钟后，大约有近30%的酵母菌死亡，说明美蓝虽为温和染色剂，但长时间后菌体依然会被染色剂破坏或缺水导致大量死亡。

2.酵母菌的出芽有三种方式，一端出芽，两端出芽和多边出芽，在这次的实验中，出芽效果仅观察到一个一端出芽。

3.子囊孢子的染色没有看到结果，可能是菌株本身的问题。

（以下两幅图是同一视野的上下两部分，图片有部分重叠）
活酵母
死酵母
正在出芽的酵母（一端出芽）
长在气生菌丝上的孢子丝
气生菌丝
1.放线菌的菌落呈灰褐色，有土腥味。

2.呈菌丝状生长，以孢子繁殖。

显微镜下菌丝呈浅绿色，孢子丝呈深蓝色。

3.气生菌丝整体上呈现一种纤细的感觉，像细长的柳枝；基生菌丝整体上呈现一种交联的感觉，像皲裂的泥土。

孢子丝细看可见小小的粒状结构，呈螺旋状，易落在视野的任何位置。

4.观察方法：先在视野中找到气生菌丝和基生菌丝交界的地方，有很多的孢子丝，或者零碎的孢子；然后一侧是基生菌丝，另一侧是气生菌丝。