黑曲霉发酵生产α-淀粉酶前言：α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。

耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。

自从日本研究者YasujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。

通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。

初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。

整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。

在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。

最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。

正文：一、实验目的1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。

2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理1.蒸汽系统：蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。

2.温度系统：(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。

(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。

(3) 发酵过程自动控温系统3.空气系统：空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。

5.在线控制系统6.进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口）7.管道：包括水流通管道和气流通管道水流通：冷却用水：水经过进水管道发酵罐夹套出水口保温用水：关闭进出水管道阀门（水注满后）进入夹套气流通：蒸汽发生器蒸汽管道空气过滤器/发酵罐进入罐内空气：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐三、方法与注意事项㈠原则1.通蒸汽前先关闭所有阀门2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。

3．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。

4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。

5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。

但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。

6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。

8．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。

㈡空消先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。

2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。

3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。

4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。

保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。

5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。

（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。

近罐空气阀的尾阀要一直微开启。

注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。

㈢种子制备：接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。

㈣培养基配制、实消发酵培养基配方：可溶性淀粉200 g，柠檬酸氢二铵100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡剂（植物油）5 mL。

关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。

㈤冷却接种与发酵待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。

将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。

㈥参数监测每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。

Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。

Ⅱ. 生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3-5 min)离心，收集上清液，用小离心机（10000rpm，1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。

Ⅲ. 酶活：试剂：（1）碘液：称取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。

（2）稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。

此溶液现配现用（3）0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的缓冲液中。

继续煮沸2分钟，冷却至室温，定容至100mL。

此溶液需要当天配制(4) 磷酸缓冲液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)方法：取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入适当稀释(6.0的磷酸盐稀释缓冲液)的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。

取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色，在620 nm处测光密度。

以0.5 ml水代替0.5 ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入6.0的磷酸盐稀释缓冲液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。

取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色）。

酶活力根据下式计算：酶活力（u/ml）＝(R0-R)/R0×50×D，式中R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。

调整D使(R0-R)/R0在0.2-0.7之间。

确定在40℃、5 min 内水解1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。

Ⅳ. 残糖量的测定：硫酸-蒽酮法测残糖含量（1）原理糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620 nm处有最大吸收，显色与多糖含量有线性关系。

（2）试剂①蒽酮试剂。

溶解0.2 g蒽酮于浓硫酸（A. R. 95.5 %）100 ml中，当日配制试用。

具体实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。

比如实测样品有50份，为了保证结果的可靠性，安排个份样品试验重复数为3。

因为每个试验点实测需要4 ml蒽酮试剂，所以至少应配置的体积为4×3×50＝600 ml。

此时还应考虑预实验和实验差错所消耗蒽酮试剂量。

②标准糖试剂。

葡萄糖溶液（可加数滴甲苯防腐）（3）操作及其注意事项分别取0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80 ml，用蒸馏水补到1.00 ml，分别加入4.00 ml蒽酮试剂，迅速进入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。

自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10 min，冷却后进行比色。

以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。

或使用计算器进行一元回归得出计算式，以便于计算使用。

（4）样品含量测定取糖浓度为50μg/ml左右的样品溶液1.00ml，一式3份分别置于不同试管中，对照加入1.0ml蒸馏水，然后给各管加入蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。

根据标准曲线和样品浓度计算含量。

色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。

此外，试管在加入蒽酮试剂过程中，移液管尖端在试管中所停留的高度对于加入蒽酮试剂的速度影响较大，而且对反应产生颜色的深浅都会产生一定的影响。

因此，实验操作应该注意。

㈦后续工作：罐体清洗，药品整理归类，物品放好㈧数据处理(1)葡萄糖标准曲线0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.80.001 0.052 0.159 0.274 0.435 0.671 0.882 （2）发酵液pH值的变化发酵液ph随时间变化曲线图生物量(g)的变化00.050.10.150.2010203040506070时间（h）生物量（g ）生物量(g)残糖含量变化00.511.522.5010203040506070时间（h）残糖含量（g /L )残糖含量（3）生物量的变化生物量随时间变化曲线图（4）残糖量变化残糖含量随时间变化曲线图酶活变化02000400060008000100001200014000010203040506070时间（h）酶活酶活 （5）酶活变化酶活随时间变化趋势四、实验结果分析1、pH 值得变化：0-6h 变化幅度不大，此时菌处于潜伏期内种代谢不旺盛，故pH 的变化不大。

12-18小时有所波动，可能是取样时出现误差，理论上应该是在0=18小时变化不大。

18小时过后，随后随着菌种的活化，菌种新陈代谢的旺盛CO2的释放增加，pH 值逐渐下降，且下降速度逐渐加快。

2、生物量变化：理论上生物量整体上是呈上升趋势。

但是在18小时时，出现生物量很明显的增大，显然数据出现误差。

可能是烘干时没有干的彻底，杂质掺入，或是统计数据时出现错误。

在这之后，生物量出现缓慢上升趋势，这是因为在发酵期间培养基的营养成分是够黑曲霉生长所需的,它的增殖受到环境的影响不是很大,故其一直在增殖.第60小时数据偏低，可能是离心不彻底使部分产物损失。

此外生物量曲线出现较大的波动可能是操作的人员不同，实验手法也不一样，导致最终结果有所偏差。

3、残糖的变化：理论上应该是越来越小，但是实验中残糖的波动比较大，归结原因可能如下： 1、试验中所使用的蒽酮和淀粉溶液不是现配现用，尤其是淀粉溶液时间稍长就会出现沉淀，这是结果波动性变化大的最主要的原因；2、操作不规范，稀释倍数不合理，也可能导致数据波动性较大3、发酵罐中的温度没有控制好，对此也有较大影响。

4、由于本实验是分批次进行的，因此实验操作者也不是唯一一个人，不同的操作者都有不同的操作习惯，步骤也不一定相同，可能也会导致数据波动4、a-淀粉酶的活力：总体上是呈上升趋势，0-36h内酶活测定数值比较小，因为在发酵初期，有一段时间的延滞期，由于菌种的代谢慢，总量少。

36小时候，由于菌种达到对数期和稳定期黑曲霉的产酶能力加强，酶活不断升高，且上升幅度也大大提高，数量增加以后产生的酶量便不断增加。