交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发士交联作用，制成网状结 构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌 体或菌体碎片的固定化。

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸 酐．双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。
交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时 间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团 被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或 固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。
此法常用载体有羧甲基纤维素、CM—Sephadex、聚天 冬氨酸、BioGel.CM—100、乙烯—顺丁烯二酸酐共聚物、 Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下： 以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。
首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤， 干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCL气体，使之 饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、 乙醚充分洗涤，并空气干燥。将产物悬于甲醇中，加入80％ 水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。
固定化酶既保持了酶的催化特住，又克服了 游离酶的不足之处，具有增加稳定性，可反 复或连续使用以及易于和反应产物分开等显 著优点。
固定化酶的优点 以及局限性
优点：

不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。
缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 固定化酶活力回收率低，且不适合用于 高分子质量的底物。
现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶 （coupling gel）。偶联凝胶有多种型号，在实际应用时，选 择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简单地制备 固定化酶。 在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使 用条件，另一方面要了解酶的结构特点，避免酶活性中心的 构象变化而影响酶的催化能力。
使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、 溴化氰法和烷化法等。现分述如下：
①重氮法
将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐 衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，此衍生物与酶蛋白分 子中酪氨酸的酚基或组氨酸的咪唑基发生偶联反应，而成固定 化酶。
重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸 酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下 与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业 生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶 应用史上的一大变革。 此后，固定化技术迅速发展，促使酶 工程作为一个独立的学科从发酵工程 中脱颖而出。
固定化酶是指固定在载体上并在一定的空 间范围内进行催化反应的酶。
例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将 Sepharose 4B用蒸馏水洗净，含0.1g干物质的湿胶加5ml 水和4ml现配溴化氰水溶液(25mg/m1)，搅拌下用 2mol/LNaOH调pH ll.0，23—25℃反应6min，抽干立即用 300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净, (5—8min内完成)。活化 的载体用0.025mol/L pH10.2（含0.02mol/L CaCl2）硼酸 缓冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧杯内加16mg结 晶胰蛋白酶，搅拌4h，用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液(内含 1mol/L NaCl)洗涤后，复用pH4.1的醋酸缓冲液洗涤，便制 成了固定化胰蛋白酶。
要使载体与酶形成共价键，必须 首先使载体活化，即借助于某种 方法，在载体上引进某一活泼基 团。然后此活泼基团再与酶分子 上的某一基团反应，形成共价键。
固定化酶的制法是：利用酶所带的官能团（－NH2， －COOH，－SH，咪唑基，苯酚基等）与高分子化合物的官 能团进行反应制得，例如将含－C6H4NCS的聚丙烯酰胺的 官能团－C6H4NCS与含－NH2的酶中的官能团－NH2作用，可 得以下固定化酶：
二、 酶固定化
一、酶固定化的方法
载体偶联法（键合法）
使酶分子上的某些非必需的游离基团通 过共价键（离子键）与不溶性载体结合 的固定化方法叫做共价键合法（离子键 合法）。 （键合法或载体偶联法）。
离子结合法
酶分子
含有离子交换基团的固相载体
在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离 基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法， 称为离子键合法。
载体的选择
载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对 载体的一般要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶 活力及其稳定 性上都优于疏水载体。 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械 强度。 ③载体必须有在温和条件与酶共价结合的功 能基团。 ④载休没有或很少有非专一性吸附。 ⑤载体来源容易．便宜．并能反复使用。
常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶等，其它还有各种合成的离子交换树脂如Amberlite XE97、Dower-50等。通常50~150mg蛋白/g载体。
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
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③溴化氰法：
含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶等，可用溴化氰活化生成活泼的亚氨基碳酸衍 生物,在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生 固定化酶。
此法能在非常温和的条件下与酶蛋白的氨基发生反 应,已成为近年来普遍使用的固定化方法,尤其是溴 化氰活化的琼脂糖已广泛用于制备固定化酶以及亲 和层析的固定化吸附剂。
可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生 成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与 酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成双偶 氮化合物。
②叠氮法
带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先 在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用肼处 理形成酰肼，最后在HNO2作用下转变成叠氮 衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、 酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解 掉，使之仅与一NH2反应。
淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?
固定化菌体
用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分 高纯化后的酶。 随着固定化技术的发展，也可采用含酶菌体 或菌体碎片进行固定化，直接应用菌体或菌 体碎片中的酶或酶系进行催化反应，这称之 为固定化菌体或称固定化死细胞。
1973年，日本首次在工业上成功地应用固定 化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁 烯二酸连续生产L—天门冬氨酸。
④烷基化法： 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代 物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。
活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟 基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。
用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会 脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，比 较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象而影响 酶的催化活性。
1986年，郭勇等人首次用固定化原生质体生产 细胞间质中存在的碱性磷酸酶，取得可喜成果， 随后，又进行了固定化原生质体生产葡萄糖氧 化酶和谷氨酸脱氢酶等的研究，为胞内酶生产 技术路线的变革提供了新的方法。
固定化细胞和固定化原生质体以酶 等各种代谢产物的生产为目的，它们 可以代替游离细胞进行酶的发酵生产， 具有提高产酶率，缩短发酵周期并可 连续发酵生产等优点。在酶的发酵生 产中有广阔的发展前景。
第章四 酶、细胞、原生质体固定化
一、概述
酶具有专一性强，催化效率高和作用条件温和等显 著特点，但是在使用酶的过程中，酶存在不足：
Immobilized enzyme
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的格鲁布霍费（Grubhofer） 和施莱思（Schleith）采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后， 分别与羧化酶、淀粉酶、胃蛋白海、核糖核酸酶等结合，而制成固定化 酶。 20世纪６０年代初，以色列科学家发现生物细胞里的许多酶并不是单独 在水溶液里起作用，而是包埋在细胞膜里或其他细胞器里面起作用的。 于是，他试着把分离得到的酶结合到某种不溶于水的载体上，或者是包 埋于天然的或人工合成的膜上，这样就装配成了固定化酶。接着又对固 定化酶的催化特性进行观察，发现许多酶经过固定化以后，活性丝毫未 减，稳定性反而提高了。在反应容器里，固定化酶可以反复利用，成百 上千次发挥效能，以不变促万变。 这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。在此基 础上，酶的固定化技术日新月异。
1979年，固定化毛地黄细胞和 长春花细胞的研究成功，推动了固 定化植物细胞和动物细胞的研究， 为动植物来源的天然产物的工业化 生产开辟了新的途径。
固定化原生质体
1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产 谷氨酸，取得进展。说明细胞制备成固定化原 生质体后，由于有载体的保护，稳定性较好， 同时由于解除了细脑壁这一扩散障碍，更有利 于胞内物质约分泌。
其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2％HCL在冰浴中混合， 搅拌下滴加9ml %3 NaNO2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去 上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤． 再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH8．7磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5℃搅拌 反应2—3h，用HCL凋PH4，冷0.001mol/L HCL洗三次，冷 水洗一次，冻干，即为固定化酶。
固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目 的，它们的制备和应用方法也基本相同
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期 出现了固定化细胞技术。固定化细胞是指固定在载体 上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称 为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌 细胞生产α-淀粉酶的研究成功，开始了用 固定化细胞生产酶的先例。 郭勇等人从1984年开始，在国内首次进行固 定化细胞生产α淀粉酶、糖化酶和果胶酶等 的研究，取得良好效果。