关木通肾毒性机制的实验研究马红梅,张伯礼,徐宗佩,孙静美,李　苓史　红,王同胜,王津生,戴品忠,杜文复(天津中医学院,天津300193摘要:[目的]研究揭示关木通肾毒性的组织、细胞学机制。

[方法]建立体内短期肾毒理动物模型和体外培养牛肾间质成纤维细胞模型,分别观察关木通(9g/kg)及其复方(30g/kg)对体内动物模型、关木通鼠血清和关木通主要毒性成分马兜铃酸及其鼠血清对体外细胞模型的毒性影响,并进一步采用高效液相色谱法检测马兜铃酸鼠血清中马兜铃酸及其代谢产物的含量。

[结果]关木通组动物体重明显减轻(P<0.01),并出现蛋白尿和尿糖,关木通复方组动物体重增长缓慢(P<0.05),也出现蛋白尿,但未见尿糖,关木通及其复方组均可见肾小管上皮细胞变性、脱落,间质血管瘀血,肾小球基本正常或有轻度基膜皱缩;关木通和马兜铃酸鼠血清均对牛肾间质成纤维细胞的生长有显著抑制作用(P<0.01),且该抑制作用不随马兜铃酸I血药浓度的递减而减弱,而与血药浓度相对稳定的马兜铃酸代谢产物马兜铃内酰胺Ⅰ相关。

[结论]在动物模型上确证大量短期服用关木通及其复方均出现肾毒性,并呈现急性肾小管上皮细胞损伤为主而不伴肾间质纤维化的组织病理学特点;证实关木通真正的肾毒性成分还有其固有的和体内代谢生成的马兜铃内酰胺,其作用位点并非局限于肾小管上皮细胞,至少还有肾间质成纤维细胞,该细胞生长受显著抑制的现象与慢性马兜铃酸肾病寡细胞性肾间质纤维化的病理特点相一致。

关键词:关木通/中毒;@关木通复方/中毒;马兜铃酸/中毒;@马兜铃内酰胺/中毒;@肾毒性/病因学; @肾小管上皮细胞/病理生理学;@牛肾间质成纤维细胞/病理生理学;疾病模型,动物;细胞,培养的中图分类号:R285.5;R692.6 文献标识码:A 文章编号:1003-9783(2001)06-0404-06 关木通肾毒性机制至今不清。

值得注意的是:国内外报道的关木通肾毒性病例的临床病理特点不同,前者属超量短期服药,表现为急性肾毒性反应,后者是小剂量长期服药,呈现慢性肾毒性反应[1]。

为深入揭示关木通肾毒性机制,我们建立了体内短期肾毒理动物模型和体外培养牛肾间质成纤维细胞模型,分别观察关木通及其复方对体内动物模型、关木通鼠血清和关木通主要毒性成分马兜铃酸及其鼠血清对体外细胞模型的毒性影响,并进一步采用高效液相色谱法检测马兜铃酸鼠血清中马兜铃酸及其代谢产物的含量。

从而在体内外分别确证急慢性关木通肾毒性反应的病理学特点,并在细胞水平上首次证实关木通真正的肾毒性成分及其确切作用位点。

1　材料和方法1　药剂　(1)关木通(Caulis Aristolochiae Manshuriensis,系马兜铃科马兜铃属木通马兜铃Aristolochia Manshuriensis K om.的木质茎,由天津中药集团公司第二批发部提供,1998, 4)水煎浓缩备用。

(2)关木通复方(当归四逆加吴茱萸生姜汤旧方颗粒剂,每10.5g约含关木通1g,由日本 } 株式会社提供, 1998,4)水溶备用。

(3)关木通鼠血清,正常Wistar大鼠4只,体重250～305g (274.25±24.18g),天津医科大学动物室提供。

分别以上述关木通和蒸馏水制剂各灌胃2只大鼠,关木通剂量为60g/kg,灌胃后3h分别于股动脉无菌取血,分离血清,-20℃收稿日期:2001-06-25作者简介:马红梅(1967-),女,博士,副教授基金项目:天津市自然科学基金资助项目(983609311),天津市青年科学基金资助项目(973707311)保存备用。

(4)马兜铃酸溶液的制备,以10%新生小牛血清RPMI1640培养液调制马兜铃酸(中国药品生物制品检定所提供)储备液,浓度1mg/m L,pH7.0,过滤除菌,-70℃保存。

用时分别稀释为10μg/m L、5μg/m L、1μg/ m L、0.5μg/m L、0.1μg/m L、0.01μg/m L共6组剂量。

(5)马兜铃酸鼠血清制备,正常Wistar大鼠7只,体重254g～325.9g(292.88±29.24g),天津中医学院一附院动物室提供。

以马兜铃酸纯品(中国药品生物制品检定所提供)混悬液灌胃,剂量为5mg/kg,在灌胃前(T0)及喂药后1h(T1)、2h(T2)、3h (T3)、4h(T4)、5h(T5)、6h(T6)分别于股动脉无菌取血,分离血清,-20℃保存备用。

1.2　模型与检测1.2.1　动物模型:昆明小鼠(中国医科院实验动物繁育场提供,二级清洁动物)59只,体重18～22g,适应性喂养后随机分为①关木通组(n=20)、②关木通复方组(n=20)、③阴性对照组(n=19),按成人剂量扩大20倍计算,每日灌胃1次,进药量依次为①9g/kg、②30g/kg③等量蒸馏水。

连续灌胃7d 后,称重,代谢取尿,取血杀检。

检测给药前后体重(W)、血红蛋白(HG B)、血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、血和尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿常规(RT)包括尿糖(G LU)和尿蛋白(PRO),光镜下观察肾小球及小管-间质病变。

1.2.2　细胞模型:体外培养和鉴定牛肾间质成纤维细胞[2-5]。

检测采用MTT法(四唑盐比色试验)。

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝):美国SIG MA;DMS O(二甲基亚砜):北京亚太精细化工公司(分析纯);酶标仪:美国BI ORAD.m odel550.λ=595nm。

取第4-6代培养的牛肾成纤维细胞,消化后,以2×104/ m L细胞密度植入96孔板,于37℃、5%C O2培养箱内孵育24h后分别加入关木通鼠血清(以等量蒸馏水鼠血清为阴性对照)、不同浓度马兜铃酸溶液(包括10μg/m L、5μg/m L、1μg/m L、0.5μg/m L、0.1μg/m L、0.01μg/m L 共6组剂量,以10%新生小牛血清RPMI1640培养液为阴性对照组)和不同时相马兜铃酸鼠血清(包括服药后1h、2h、3h、4h、5 h、6h共6组时相,以服药前不含马兜铃酸的鼠血清为阴性对照组),二鼠血清组均以10 %新生小牛血清RPMI1640培养液10倍稀释,每组设6个平行孔,继续培养24h,终止培养前4h加MTT溶液(5mg/m L)20μL/孔,置37℃、5%C O2培养箱继续孵育4h,终止培养,弃上清液,加DMS O150μL/孔,振荡5～10min在酶标仪上测定各孔光吸收值(A值)。

连续测3d。

1.2.3　马兜铃酸鼠血清中马兜铃酸及其代谢产物的含量的检测:采用高效液相色谱法。

马兜铃酸Ⅰ(AAI)、马兜铃酸Ⅱ(AAII)和马兜铃内酰胺Ⅰ(A LI)的标准品由北京医科大学生药研究室提供。

检测仪器包括UV-1601型紫外分光光度计、810系统计算机、检测器Waters490E、510泵。

流动相∶甲醇∶水∶乙酸=70∶30∶0.5;测定波长λ:310nm;保留时间:AAI为10.39min,AAII为 5.39min,A LI为13.63min。

1.3　统计　采用t检验、方差分析和q检验。

2　结果1　关木通及其复方短期肾毒理动物实验　结果见表1～2,连续灌胃7d后,关木通组动物体重明显减轻,ΔW=-0.11±0.88g,(P <0.01);并出现蛋白尿和尿糖(P<0.01),关木通复方组动物体重增长缓慢(P<0.05),也出现蛋白尿,但未见尿糖。

关木通及其复方组均可见肾小管上皮细胞变性、脱落,间质血管瘀血,肾小球基本正常或有轻度基膜皱缩;各组血红蛋白、血肌酐、尿素氮、血尿酸、血尿β2-微球蛋白、尿NAG均未见明显变化。

表1　关木通及其复方对小鼠体重和血红蛋白的影响( x ±s )分　组N /例ΔW/gHG B/(g ・L -1)关木通组20 -0.11±0.8833138.49±29.72关木通复方组20 1.81±1.083158.81±11.87阴性对照组193.23±1.68154.03±8.59参考标准[6]2.05±1.17100～170 注:与阴性对照组比,3P <0.05;与各组比,33P <0.01。

表2-1　关木通及其复方对小鼠肾功能的影响( x ±s )分组N /例BloodSCR/(m ol ・L -1)　BUN/(mm ol ・L -1)　UA/(m ol ・L -1)　β2-MG/(mg ・L -1)关木通组2045.65±6.27336.20±1.95289.93±46.610.008±0.010关木通复方组2044.84±5.81 2.96±0.5233269.68±61.060.032±0.033阴性对照组1934.10±5.79 6.64±1.54234.80±53.940.011±0.0169参考标准[6]27～885.0～10.060～297 注:与阴性对照组比,3P <0.05;与各组比,33P <0.01。

表2-2　关木通及其复方对小鼠肾功能的影响( x ±s )分组N /例Urineβ2-MG/(mg ・L -1) NAG /(u ・L -1) G LU/(mm ol ・L -1) PRO/(g・L -1)关木通组200.0004±0.00078.00±4.24 5.55±7.850.70±0.0033关木通复方组200.0013±0.0010 4.00±4.2400.15±0.21阴性对照组190.0006±0.00072.00±1.41参考标准[6] 注:与阴性对照组比,3P <0.05;与各组比,33P <0.01。

2.2　关木通及马兜铃酸对牛肾间质成纤维细胞生长的干预实验2.2.1　关木通鼠血清对体外培养牛肾成纤维细胞的影响(图1):加入关木通鼠血清第3天,成纤维细胞的生长受到明显抑制,与阴性对照组比有非常显著性差别(P <0.01)。

2.2.2　马兜铃酸溶液对体外培养牛肾成纤维细胞的影响(图2):马兜铃酸溶液在实验浓度范围内(10μg/m L 以下),对体外培养牛肾成纤维细胞的生长无显著影响(P >0.05)。

2.2.3　马兜铃酸鼠血清对体外培养牛肾成纤维细胞的影响(图3): 加入AA鼠血清第2天时,成纤维细胞的生长受到明显抑制(P<0.01),各血药组间无显著差别(P>0.05),服药后3h和5h 时抑制率分别达52%和57%,可见其作用持续。