基因诊断和治疗的最新应用与发展摘要基因诊断与基因治疗是现在能够在较短时间从理论变为现实。

主要利用分子生物学的理论及技术方法，使人们可以在实验室构建各种载体，克隆及分析目的基因。

所以对疾病能够深入到分子水平的研究并已取得了重大的进展。

因此在20世纪70年代诞生了基因诊断，随后于1990在美国实施了第一基因治疗的临床试验方案，可见机芯诊断和基因治疗是现代分子生物的理论和技术与医学想结合。

关键词基因诊断、基因治疗1.基因诊断的原理与方法基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与基因功能异常有关。

基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能，特别是RNA产物是否正常。

由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等，均可造成相关基因结构变异，采用特异的DNA探针与靶基因进行分子杂交，可以直接检测上述的变化。

基因诊断的方法基因诊断是以核算分子杂交和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。

2、DNA诊断常用检测治病基因结构异常的方法有下列几种（1）斑点杂交：根据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。

（2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后刻作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。

一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。

如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检2条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一天染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO 杂交，说明受检者不存在该种突变基因。

若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。

此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和在盒子的诊断很方便。

也克分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的点突变。

（3）单链构象多态性分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。

一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。

PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，此法可用监测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。

（4）限制性内切酶图谱分析，如果DNA突变后改变了某一核酸限制性内切酶的识别位点，，使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目发生改变。

一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变。

如果用PCR扩增该突变点的外显子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后刻直接观察片段的大小及数目。

此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。

（5）限制性片段长度多态性遗传连锁分析人群中个体间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。

有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。

RFLP按孟德尔遗传方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这已多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因。

此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症等。

（6）DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常最直接和准确的方法。

RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录的质和量，以判断基因转录效率的高低，以及转录物的大小。

（1）R NA印迹RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。

（2）R T-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，若与荧光定量PCR结合可对RT-PCR 产物量进行准确测定。

3．基因诊断的应用（1）诊断疾病单基因遗传病的基因诊断标准型α地中海贫血症，是由于1条16号染色体上2个α珠蛋白基因全部缺失，另一条16号染色体上具有2个正常的α珠蛋白基因，DNA诊断结果，EcoRI和BamHI都出现与正常一样的23kb或14kb的条带，但杂交条带的放射自显影较正常入浅。

染色体病的基因诊断染色体病是一类危害严重的遗传病，过去主要依据临床表现。

核型分析和生化检查进行诊断，不仅耗时费力，而且缺乏特异性。

现在采用定量PCR扩增技术，可快速诊断三体综合征；采用多色荧光标记的FISH探针技术，一次可同时诊断多种染色体病，并可检测出小至50kb 的染色体微小异常（缺失、插入和异位等），大大提高了染色体病诊断的敏感性和效率。

肿瘤的基因诊断肿瘤是体细胞遗传病，发生和发展过程相当复杂，其中癌基因和抑癌基因的结构和表达的异常是病变的重要因素。

观察不同类型的肿瘤细胞发现，有的癌基因在固定位点上发生高比率点突变；有的癌基因放大；有的丢失了抑癌基因；有的发生了基因重排等。

对肿瘤进行基因诊断，不仅可以研究细胞癌变的机制，还可以对肿瘤进行分类分型，在不同的环节上指导抗癌。

（2）对获得性疾病的诊断获得性疾病主要是指感染性疾病，是由于感染了病原体而致病。

病原体种类繁多，包括病毒、真菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体以及寄生虫等。

病原体基因诊断的样本是病原体自身特异性核酸序列。

基因诊断的目的就是通过分子杂交和基因扩增等手段，去发现和鉴定这些独特的外源性基因组、基因或基因片段在人体组织中是否存在，从而证实是否感染了某种病原体。

目前，基因诊断已在病毒性肝炎、艾滋病等遗传病的诊断中发挥重要作用。

产前诊断产前诊断可以通过胎儿组织活检、羊膜腔穿刺、羊膜绒毛样品及母体血液循环中的胎儿细胞进行。

可以进行染色体组型分析，发现染色体异常，但利用PCR技术结合DNA诊断学方法分析特异基因缺陷更宜推广携带者测试基因测试常用于检出隐性遗传病携带者，包括遗传病受累个体家庭的其他成员和有特殊遗传病死亡家庭中的危险人群。

例如对3个缺失型和一个非缺失型Duchenne甲肥大营养不良家系缺失DNA片段PCR定量分析和SRR-PCR连锁分析，对4个家系17名成员（患儿5名、女性亲属7名、男性亲属5名）进行了基因检测。

检测结果发现了4名女性为治病基因携带者，肯定了7名女性为非携带者，为这些家系提供了可靠的遗传信息。

以上检测方法简便易行，利于在临床实验室中开展症状前诊断对于某些单基因乱引起的综合征，仅至晚年才会有明显表现，例如肝豆状核变性的症状前诊断及干预治疗，应用短串联重复序列标记对40个肝豆状核变性家系进行单体型连锁分析，在先证者的81例无症状同胞中，检出11例症状前患者。

对其中8例投用硫酸锌治疗，效果良好，在预防症状出现的同时，提高了血清铜蓝蛋白水平。

强调症状前诊断及干预治疗的重要性。

4．基因治疗基因治疗的定义从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。

若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。

导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。

基因治疗有两种方式。

一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗，另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗，从理论上讲，若对缺陷的升值细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。

但升值的生物学及其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果。

涉及一系列的伦理学的问题，目前还不能用于人类。

在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。

基因治疗的方式基因治疗的方式主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的一次序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因为不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。

另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。

再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。

除上述3大类外，今日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。

导入的方式导入基因的两种方式，一种是体外导入，即在体外将基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体内表达，从而达到治疗或预防的目的。

被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。

合适的细胞应易于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能在体内长期存活。

目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、多种肿瘤细胞等。

另一种是体内导入，即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。

单基因病单基因病是指由1对等位基因控制的疾病或病理性状。

由于基因是位于染色体上，而染色体有常染色体和性染色体之分，基因也有显性基因与隐性基因之别，故位于不同染色体上的致病基因，其遗传方式是不同的，因此，单基因病中又可分出常染色体显性遗传病(如短指症等)、常染色体隐性遗传病(如白化病等)、x伴性显性遗传病(如抗维生素D缺乏病等)、x 伴性隐性遗传病(如色盲等)、Y伴性遗传病(如耳廓长毛症等)等几类。

目前应用基因治疗的单基因疾病已有二十多种。

恶性肿瘤恶性肿瘤属复杂基因疾病，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。