● 温度匹配 流动相须预热至柱温，温度匹 配可以使柱效提高50%以上。
柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速 降到一固定值（如35℃），以避免检测信号 的波动。
● 色谱柱 以硅胶为基质的填料，其使用温 度一般不超过60℃；HTLC使用以氧化锆、 多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采 用多配位基有机硅胶为填料。
1、温度 柱温提高到40℃以上，谓之 HTLC（40℃—200℃）
● 温度上升→流动相粘度下降→流速增加 （≤8ml/min）→容量因子K下降→保留时
间缩短
●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料 （＜3um）或长色谱柱→提高柱效
●提高灵敏度 色谱峰高与柱温呈指数函数 关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系
1、柱效与流速的关系 存在最佳流速
2、柱效与填料粒径的关系
a）A=2λ·dp 式中 2λ为与填充均匀性有关的因数 dp为填料的粒径
b）小的dp有利于传质
c）减小填料粒径可显著提高柱效
由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短
恒压
色谱柱 → 增加流速
↓
↓
缩短洗脱时间
三、影响分离效果的其他因素
适当改变流动相的组成、组分的比例或添加 调节剂。
5、N与α对Rs贡献的比较
二、Van Deemtor方程
h=A·F1/3+B/F+Cm·F+Cs·F=A·F1/3+C·F 式中 h=1/N 理论塔板高度
F=流动相流速 Cm，Cs=溶质在流动相和固定相中的浓度 B=纵向扩散的贡献因子（纵向浓度梯度） A=涡流扩散的贡献因子（色谱柱的不均匀性） 溶质在液体中的扩散系数比气体中小4—5个数 量级，所以在HPLC中在通常的流速条件下B项的贡 献可忽略 不计。
HPLC色谱条件的优化与色谱
混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的 差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内 容属于色谱热力学的范畴。
容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因 子α决定了组分的分离选择性。这二个重要的色 谱参数都取决于溶质、固定相和流动相的热力学 性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下， 只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这 种差异又足够大时，就有可能实现分离。
溶剂 正己烷 乙醚 三乙胺 环己烷 醋酸乙酯 三氯甲烷 四氢呋喃
苯 二氯甲烷
δ
溶剂
δ
7.3
二氧六环 9.8
7.4
丙醇
10.2
7.5
乙醇
11.2
8.2 二甲基甲酰胺 11.5
8.6
乙腈
11.8
9.1
醋酸
12.4
9.1
甲醇
12.9
9.2
甲酰胺
17.9
9.6
水
21
对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解 度参数（δ）基本呈平行关系。
混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平 均值。
溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量 因子10倍的变化。
3、N 理论塔板数 a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2 b）N对分离度的影响 Rsα N c）提高柱效的方法 ● 增加柱长 ● 改进柱填料（纯度、物理性状） ● 提高填装质量
4、α 分离因子 a）α= K2/K1 = t＇R2 / t＇R1 b）α对分离度的影响 Rs α（α-1）/α 影响敏感，α的微小变化可显著改变Rs c）改变α的方法 在保持流动相极性基本不变的前提下，
2、pH 引入次级化学平衡（电离、络合、 离子对等）改变溶质的浓度或存在形式，用 以提高选择性。
3、柱外效应 UPLC的技术要求 V池＜0.1 V柱（2—5ul） V管路＜0.1 V柱（0.1mm,id） V进样＜0.15V峰（2—5ul） tC＜0.1tR（10—15S，自动进样器） V死＜0.3ml
峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈 指数增加，数据表明，柱温从30℃上升至 90℃，定量限约可降低10倍。
●改善选择性 不同溶质的保留时间随柱温 变化的程度不尽相同，有可能使原来未分 离的成分的得到基线分离，甚至发生洗脱 顺序逆转。
这种温度使选择性改变的特性在混合物 的分离中非常有用，因为它只需简单地改变 柱温，而无需改变其他色谱条件。
b）Rs＜0.8 不符合分析化学要求
Rs=1
二峰重叠2%
Rs＞1.2 二峰完全分离
2、K 容量因子 a）K=（tR-tO）/to b）K对分离度的影响 Rs α k/（K+1）
一般K取2-10，以2-4最好。 c）改变K的方法
改变流动相的溶剂强度（常以溶剂的溶解 度参数或极性参数表示）。
常用溶剂的溶解度参数δ（25℃）
3、综合评估 a）结合效率和成本考虑，在不少情况下2u
的填料未必比3u的填料有太多的优势
b）采用亚-2um填料时应考虑： ● 使用现有设备的能力 ● 利用选择性的可能性
c）展望 不是现在，也许是不远的将来
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死体积的影响 ● 延迟出峰时间 ● 减低柱效 ● 使梯度曲线变形
四、UPLC（UFLC）的评估
1、优势： ● 柱效高 ● 运行时间短 ● 适用于高通量筛选 ● 便于与MS联用
2、短处： ●高柱压降（泵，摩擦生热导致柱效下降和选
择性变化） ●色谱成分残留 ●进样器交叉污染 ●供试液需径0.2u滤膜过滤 ●可选色谱柱有限 ●不太适合生物学基质样品 ●不适用于常规质量控制 ●尚未通过GLP认证
要使分离的可能性变为可行，则必须 设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的 各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于 柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗 粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、 孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素 的关系是色谱动力学的内容。
1、Rs分离度
a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或 1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2）