药物现代分析方法
第一节 毛细管电泳及其应用
(一)简介
以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通 道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上 的差异而实现分离的一种液相分离技术
电泳是电解质中带电粒子在电场作用下向 电荷相反方向迁移的现象,利用这种现象对物 质进行分离分析的方法,称之为电泳法
在散热率很高的毛细管内进行的电泳分析, 称为毛细管电泳法
氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关, 在电场力的作用下迁移,分别到达其等电点pH位置时, 呈电中性,停止移动,由此可使它们得到分离
可分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质
5 毛细管电色谱 CEC
在毛细管壁上键合或涂渍高效液 相色谱的固定液,以电渗流为流动相, 试样组分在两相间的分配为分离机理 的电动色谱过程
中性粒子 ap eo
正离子:
两种效应的运动方向一致,最先流出
中性粒子:
无电泳现象,只受电渗流影响,在阳 离子后流出(不被分离)
阴离子:
两种效应的运动方向相反,最后流出
除中性粒子外,同种类离子由于受到的
电场力大小不一样 被相互分离
HPCE中电渗流的流形
电荷均匀分布,整体移动,电渗流的流动 为平流,塞式流动(谱带展宽很小)
(二)基本装置与原理
1 基本装置
• 电压:0~30KV • 分离柱 不涂敷任何固定液 • 紫外或激光诱导荧光检测器 (可检测:10-19~10-21 mol/L)
2 基本原理
✓电泳及电泳淌度
带电粒子在电场作用下,以不同速
度向其所带电荷相反的电场方向迁移
的现象,称为电泳,速度 vep 单位电场下的电泳速度称电泳淌度
超高效液相色谱 (UPLC)的原理
UPLC的理论基础为: 范德米特(Van Deemeter)方程
HETP=A(dP)+B/v+Cu(dP)2
HETP:理论塔板高度 A:涡流扩散系数
dP:填料粒径 B:分子径向扩散系数 C:传质因子为流动相线速度
为电渗,速度veo
因电渗现象引起的液体流动叫电渗流
单位电场下的电渗速度称电渗淌度
eo
veo E
✓ 带电粒子的迁移速度
vap = 电泳和电渗流两种速度的矢量和
vap vep veo ( ep eo )E
石英毛细管:带负电荷。电渗流流向 阴极,通常 veo 约为vep 的 5-7 倍
阳离子 ap eo ep 阴离子 ap eo ep
MEKC
采 用 模 式 , 鉴 定 违 禁 药 物 ;
第二节 超高效液相色谱
自20世纪70年代以来,随着高效液 相色谱
(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)技术的不断发 C展lic,k t美o国adWdattietlres公in司h于ere2004年的匹兹堡 会议上推出了最新研制的ACQUITY超 高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC),其采用1.7 Ixm细粒径的新型固定相,可获得高达2 万块/m理论塔板数的超高柱效,并以 系统整体设计的创新技术,全面提升了 液相色谱的速度、灵敏度和分离度,造 就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形 成分离科学的一个新兴领域。
液相色谱中的液流为抛物线流型,管中心 处的速度为平均速度的2倍(谱带展宽较大)
(三)主要分离模式
1 毛细管区带电泳 CZE
最基本、应用最广的分离模式
2 胶束电动毛细管色谱 MECC
在缓冲溶液中加入超过临界浓度的表面 活性剂,形成荷电胶束,在电场力的作用下, 胶束在柱中移动
系色谱与电泳分离模式的结合,中性 分子在胶束相和溶液(水相)间分配, 疏水性强的组分与胶束结合的较,流 出时间长
特点: 抗对流性好,散热性好,分离度极高。
无胶筛分技术:采用低粘度的线性聚合物 溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、 易制备。
4 毛细管等电聚焦 CIEF
根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术 毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点
范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物),当施加直流电 压(6~8V)时,管内将建立一个由阳极到阴极逐步升 高的pH梯度
用于分离中性物质,扩展了高效毛细 管电泳法的应用范围
3 毛细管凝胶电泳 CGE
凝胶具有多孔性,类似分子筛的作用, 使试样分子按大小分离。能够有效减小组分 扩散,所得峰型尖锐,分离效率高
蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大 小无关,用CZE模式很难分离,采用CGE能获 得良好分离,DNA排序的重要手段。
第二十一章
药品质量控制中现代分析方法的 进展
➢ 药物分析中最常用的分析方法是
• 色谱分析法 • 光谱分析法 • 色谱-光谱分析法联用技术
其中
• 色谱分析法主要应用毛细管GC、高效液相 色谱法、高效毛细管电泳法
• 光谱分析法主要应用四大波谱
➢ 本章主要内容
• 毛细管电泳及其应用 • 超高效液相色谱及其应用 • 手性HPLC技术与应用 • GC-MS技术与应用 • LC-MS技术与应用 • 液相色谱-核磁共振联用技术
• 毛细管等速电泳(CITP) • 微芯片毛细管电泳(microchip
electrophoresis)
(四)高效毛细管电泳应用与进展
一、离子分析 (CZE/MECC) 二、药物及代谢产物、生物材料分析 三、手性化合物分析 四、氨基酸分析 五、肽、蛋白质、核酸分析及DNA测序 六、单细胞、单分子监测
主要特点
• 高效:n 高达数十万块/米,甚至数百万块 • 高速:可在3分钟内分离30种阴离子;1.7分钟 分离19种阳离子; 4分钟可分离10种蛋白质 • 微量:仅需 nL(10-9 L)级的进样量 • 仪器简单,低消耗:分析一个试样仅需几毫升 流动液 • 采用空心毛细管,不易产生柱污染 • 检出灵敏度和精密度均不及HPLC
ep
vep E
显然,淌度是粒子在单位电场强度、 单位时间内移动的距离
对于球形离子,淌度与该离子的半径 r、电荷q及溶液粘度η有关
ep
q
6
∴ 对于给定的介质和离子,淌度是
该离子的特征常数
✓ 电渗及电渗流
由于玻璃表面存在硅羟基,pH>3时, 形成双电层,在高电场的作用下水合阳 离子带动整体溶液向负极移动的现象称