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基因敲除小鼠的实验流程


与电场强度(小于5V/cm)成正比。
琼脂糖凝胶电泳
分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得
到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
获取鼠尾组织
每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和10ul 蛋白酶 K(20mg/ml),55度水浴过夜,至鼠尾溶解。
提DNA步骤: 1. 每管鼠尾加入300ul饱和NaCl,充分混匀, 12500rpm 离心20min 2. 取上清700ul至新的离心管中,加入预冷的异丙 醇700ul,上下颠倒混匀,动作轻柔,直至看到 絮状DNA析出为止, 12500rpm 离心20min, 弃上清 3. 加入800ul 75%乙醇于离心管中,洗沉淀, 12500rpm离心10min 4. 晾干沉淀,加入100ul的PCR级的水。
PCR扩增仪
95℃ 3min 95℃ 30sec 60℃ 30sec 72℃ 30sec 72℃ 5min 35 cycles
三、琼脂糖凝胶电泳
原理: 在pH8.0~8.3的缓冲液中,核酸分子带负电荷,
动时,各种核酸分子的迁移率 相似,无法分开。然而,在浓度适当的凝胶中,由于分 子筛效应,使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异, 从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子 大小、高级结构、胶浓度和电场强度,与分子的碱基组 成及电泳温度(4℃~30℃之间)无明显关系。一般说, 同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比,
基本实验流程
琼脂 糖凝 胶电 泳
成像 分析
获取鼠 尾组织
提取基 因组 DNA
PCR 扩增
一、动物基因组DNA的提取
实验原理 真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来
制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式
存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将 DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分 子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞 在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化
二、PCR扩增
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90¡ «95¡ æ
cycle
70¡ «75¡ æ Ñ Ó Éì Í Ë»ð 40¡ «60¡ æ
25~30 次循环后,模板DNA的含量可以 放大100万倍以上。
动画
PCR:(20ul体系)
2x Mix 无菌水 2pmol引物1 2pmol引物2 2pmol引物3 模板DNA 10ul 2ul 2ul 2ul 2ul 2ul
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