（一）CaCl2 转化法 核心： 核心：目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 H 溶液中浸泡一段时间， cell/ 107-109 cell/gD 。 NE.coli: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105 DH5 XL（1）冰上 30min 90“ （2）热激 42℃ 90 （3）恢复 1～2min 45（4）复苏 37℃ 45-60 min 原生质体转化法（protoplast） （二）原生质体转化法（protoplast） 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。 适用于 G+ 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。 过程： 过程： 等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme） （1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme） （2）细胞壁再生 电转化法（electroporation） （三）电转化法（electroporation） 缓冲液： 甘油或蔗糖， 或不含） 离子。 缓冲液：10% 甘油或蔗糖，含（或不含） Mg2+ 离子。 转化条件： 25 200-400 转化条件：2.5 KV/0.2cm 25F 200-400。
实验结果： 实验结果：下次实验观察并分析筛选结果
四、注意事项
为了提高转化效率, 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素： 细胞生长状态和密度: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接 或储于４ 的培养菌，最好从－70℃或 20℃甘油 或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油 保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好， 液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好， 可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 株的OD600 0.5时 细胞密度在5 /ml左 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左 不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。 ),这时比较合适 右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。 度过高或不足均会影响转化效率。
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基 如氨苄青霉素， 卡拉霉素等） 因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子 才能在含该抗生素的培养基上长出。 才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。 本实验利用抗生筛选转化子。
２、互补法
1、感受态细胞的制备
所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两 种假说： 局部原生质体化假说－－ －－感受态细胞的 种假说： １．局部原生质体化假说－－感受态细胞的 表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， ＤＮＡ分子 ＤＮＡ的酶位点 表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子 能进入细胞。 能进入细胞。
四、注意事项
质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA DNA应主要是 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是 超螺旋态DNA(cccDNA) 转化效率与外源DNA DNA(cccDNA)。 DNA的浓度 超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA DNA的量过多或 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA ,DNA溶液 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
一、感受态细胞的制备 ）、受体菌的培养 （一）、受体菌的培养 ）、感受态细胞的制备 （二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1.5ml（每人）培养液转入离心管中, 4℃下3000g离心 1、将1.5ml（每人）培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心 10分钟 分钟。 10分钟。 弃去上清,用预冷的0.1mol/L 0.1mol/L的 溶液1ml轻轻悬浮细胞, 1ml轻轻悬浮细胞 2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞, 冰上放置15 30分钟后,4℃下3000g离心10分钟 15- 分钟后,4℃ 离心10分钟。 冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 弃去上清,加入200 预冷的0.1mol/L 200µl预冷的0.1mol/L的 溶液, 3、弃去上清,加入200 预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮 细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年 200μl的小份 可保存半年。 4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、材料、设备及试剂 材料、
DH5a（ K12（ 菌种 ：E. coli DH5a（空）、 E. coli K12（空） eppendorf管 设备 ：eppendorf管、微量取液器 (20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， (20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡 器 试剂：LB液体培养基 试剂：LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp
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2.转化 2.转化
ＤＮＡ分子转化分以下几步: ＤＮＡ分子转化分以下几步: 分子转化分以下几步 吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； －－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面 １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入 转入－－双链ＤＮＡ分子解链。 －－双链ＤＮＡ分子解链 受体菌，另一条降解； 受体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制 －－外源质粒ＤＮＡ 成双链； 成双链； 表达一供体基因随同复制子同时复制 分裂， 一供体基因随同复制子同时复制， ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。 转录翻译。
实验四 感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 感受态细胞的制备与质粒DNA DNA的转化 一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, (Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后, 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 DNA分子进入的 的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 cells)。 (Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基 中培养，即可筛选出转化子(Transformant, (Transformant,即带有异源 中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞 分子的受体细胞) DNA分子的受体细胞)。
CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础， CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础， 法是以Mendel 其基本原理是： ℃， 其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液 大肠杆菌细胞膨胀成球状。 中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表 秒热激处理， 面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混 合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间， 合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间， 促使在转化过程中获得的新的表型， 促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐 得到表达， 药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 的选择性培养基上，倒置培养过夜， Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细 菌菌落。 菌菌落。
四、注意事项
试剂的质量: 所用的试剂, 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制, (GR. 并用超纯水配制 分装保存于干燥的冷暗处。 分装保存于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂DNA的污染： DNA的污染 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程 均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, 均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的 并经高压灭菌处理, 头等最好是新的, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的 试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、 试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, DNA所污染 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或 DNA的转入 为以后的筛选、 的转入, 杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。 要的麻烦。
现在使用的许多载体（ ＰＵＣ系列） 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大 系列 肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β ＤＮＡ的短区段 肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基 lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。 １４６个氨基酸偏码区 因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这 个偏码区中插入一个多克隆位点。 个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β 半乳糖苷酶Ｃ ａａ的序列 的序列。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当 外源基因插入时，二者溶为一体后， 外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷 酶表达， 在生色底物５ 吲哚－ 酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β －Ｄ－半乳糖苷 半乳糖苷（ gal）培养基中形成兰色菌落。 －Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点， 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失 而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 lacZ基因不表达而形成白色菌斑 活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色 不同而区分重组子和非重组子。 不同而区分重组子和非重组子。