菌种抗生素的抗性检查标准操作规程
依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。

目的：验证该菌种的抗生素抗性是否与原始菌株相符。

原理：该菌种所携带的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上能够生长。

责任：检定人员。

内容：
1 材料
1．1 材料
1．1．1 菌种：PBV
888/DH
5α
，来源于主种子批或工作种子批。

1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。

1．1．3 药品
氯化钠 NaCl 分析纯
琼脂粉分析纯
酵母粉 OXOID
蛋白胨 OXOID
氨苄青霉素 C
16H
19
N
3
O
4
S 分析纯
无水乙醇 CH
3CH
2
OH 分析纯
1．1．4 器皿
三角烧瓶（1L）、量筒（500ml、1000ml）、烧杯（500ml）、平皿、盐水瓶（250ml、500ml、1000ml）。

1．1．5 其它材料
线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯、脱脂棉。

1．2 设备
恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂
生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂
扭力天平TN-100B 上海第二天平厂
2 方法
2．1 准备工作
2．1．1 生产环境：在十万级洁净间中进行。

场地摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。

2．1．2 器皿的洁净要求
玻璃器皿经本室洗刷组处理后，用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃，60分钟）。

脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，121.3℃60分钟高压灭菌。

2．1．3．1 确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．2 确认恒温培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。

2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．4 配液
2．1．4．1 LB琼脂培养基的配制（500ml）
摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。

用扭力天平准确称取酵母粉2.5克，蛋白胨5克，NaCl 5克，琼脂粉10克，倒入500ml烧杯中，加入400ml 注射用水，用玻棒搅匀溶解，定容至500ml，混匀，倒入1L三角瓶中，分别用二层硫酸纸和一层牛皮纸包瓶口，用线绳系紧，115.6℃，30分钟高压灭菌。

贴上标签，标明液体名称、批号、配制日期，备用。

2．1．4．2 75%酒精1000ml
用量筒量取750ml无水乙醇，加入250ml无菌注射用水，置1000ml盐水瓶中，摇匀，标明液体名称、批号、浓度、日期，室温备用。

2．1．5 LB琼脂平板培养基的制作
摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，用75%酒精棉擦拭台内，接通电源。

打开电机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基500ml冷却到50℃左右，加入25mg氨苄青霉素，轻轻摇匀，倒平板，每皿20-30ml，待培养基冷却后，贴上标签，并注明名称、批号、配制日期，置37℃孵箱中孵育，判定合格后置于4℃冰箱中保存，待用。

2．3 操作步骤
2．3．1 在生物安全台中，将接种环用火焰灭菌并冷却后，用接种环取一环菌
种，划线接种LB平板培养基。

2．3．2 将接种后的LB平板倒置培养，37℃培养24小时。

2．3．3 场地摘下“使用中”标志牌，挂“待处理”标志牌。

3 结果判定
3．1判定标准
平板上如长出典型的大肠杆菌菌落，说明该菌株为氨苄青霉素抗性菌。

3．2结果观察
检测结果经二人复核后，填写工作记录，注明菌种名称、批号、检测结果、判定日期、工作者及复核者等。

4 清场
4．1 配液清场
4．1．1 药品称量后，将药品瓶盖紧，放回原处。

4．1．2 将扭力天平处理干净，放回原处。

摘下“运行”牌，挂上“备用”牌，并填写使用记录。

4．1．3 操作台面用专用抹布擦干净。

生物安全台用75%酒精棉擦拭台内，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。

4．1．4 配液瓶用毕后用纯化水冲洗干净，送本室洗刷组处理。

4．2 操作清场
4．2．1 将带有细菌的平皿送高压121.3℃，60分钟灭菌。

4．2．2 将灭菌后平皿内容物倒入垃圾桶中，用纯化水将平皿冲洗干净，送本室洗刷组处理。

4．3清场结束后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，挂“清场合格”标志牌，并填写清场记录。

5 注意事项
5．1 带菌的平皿必须先送高压灭菌处理后，再送洗刷组处理。

5．2 所有工作均应采用二人复合制。