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平滑肌细胞传代
传代时间：大部分组织块长出细胞晕， 并与相邻细胞晕相接触时就可以传代
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传代步骤：
倒掉培养瓶中的培养液
用D-Hank’s液洗两遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平 放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞 消化情况，可见到细胞质回缩，细胞 间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞 脱离消化液
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青霉素、链霉素液配制
青霉素80万U加Hank’s液至80 mL，终 浓度1万u/ mL
链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s 液至100 mL，终浓度10mg/mL
分装后至-20℃冰箱保存。
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DMEM培养液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中，将 DMEM粉1包倒入容器中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁 力搅拌溶解。
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细胞培养方法
1. 组织块培养法 2. 消化培养法 3. 器官培养法
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将组织剪成小块后接种于培养瓶 特点：简便易行、成功率较高。
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“无菌”
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细胞培养实验室
1. 无菌操作区（无菌操作室、 超净台） 2. 孵育区 3. 制备区 4. 储藏区 5. 清洗和消毒灭菌区
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培养试剂的配制
Hank’s液
(单位g)
CaCl2
0.14
KCl
0.4
KH2PO4
0.06
MgSO4.7H2O
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血管平滑肌细胞的冻存和复 苏
冻存时间：较早期传代，以防细胞因 为传代次数过多而造成细胞衰老或发 生改变，以保持实验条件的一致性。
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从供体取得器官或器官组织块后，不 进行组织分离而直接在一定环境中培 养，保持其原有器官细胞的结构和联 系并生存。
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体外培养细胞的分型
1. 贴附型: 细胞贴附在支持物上生长
2. 悬浮型：不贴附于支持物，呈悬浮生 长
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准备
1. 细胞培养实验室 2. 培养用品 3. 细胞培养液、培养基
大鼠血管平滑肌细胞的 培养
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细胞培养方法
组织块培养法 消化培养法 器官培养法
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结合生化和化学手段把已经剪切成较 小体积的组织进行进一步分离，制成 细胞悬液。
主要有： 1. 胰蛋白酶法 2. 胶原酶法 3. EDTA 法
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细胞培养方法
组织块培养法 消化培养法 器官培养法
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眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外 膜层。
放入另一盛有Hank’s液的细胞培养皿 中，剪去血管外的小分支
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放入含20%胎牛血清的DMEM中，眼 科直剪剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻 擦拭内膜层，以去除内皮细胞
放入另一含20%胎牛血清的DMEM中， 用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm
0.10
NaCl
8.0
NaHCO3 Na2HPO4.12H2O D-glucose
0.35 0.12 1.0
Phenol red
0.01
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将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中， 其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混 匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定
容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟， 4℃冰箱保存。
加NaHCO3 调PH至7.2
加青、链霉素至终浓度100u/mL 和 100ug/mL
0.22umX50滤膜过滤（负压泵抽吸）， 4℃冰箱保存。
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小牛、胎牛血清灭活 55℃水浴箱30分钟，置4℃冰箱保存 灭活前放于-20℃冰箱保存待用 临用前加入DMEM液中
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平滑肌细胞原代培养方法
动物：大鼠150～180g，2～3只
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操作步骤
大鼠颈椎脱臼致死 固定
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消毒胸腹部
大组织镊、组织剪切开胸腹部皮肤
另一组织镊、组织剪切开胸腹部，并 切除部分胸壁以利暴露
眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并 放入盛有Hank’s液的细胞培养皿中， 转入无菌室。或先用生理盐水漂洗， 再放Hank’s液中，转入无菌室
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用吸管把组织块转入玻璃培养皿中， 均匀贴壁，组织块的间距为0.5cm
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盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底 朝上，并向瓶内注入适量培养液，于 37ºC孵箱内放置4～5小时，使得组织 块干涸，并与瓶底贴附
将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完 全浸入培养液中，继续静置3～5天， 切勿移动。待有细胞从组织块周围游 离出后换液
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D-Hank’s液
（单位：g）
KCl
0.40
KH2PO4
0.06
NaCl
8.0
NaHCO3
0.35
Na2HPO4.12H2O
0.08
Phenol red
0.02
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将以上成分溶于900mL ddH2O中，充 分混匀，加ddH2O至1000 mL。高压蒸 气消毒10分钟，4℃冰箱保存。
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注意：
初次传代对胰酶敏感，加入消化液30s， 即消化充分，以后2分钟左右
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细胞消化完成后，用吸管反复抽吸打 散细胞
中止消化：加入DMEM培养液3滴管， 用吸管反复吹打瓶壁细胞
离心：1500 X5分钟
倒掉液体，加D-Hank’s液洗一次，再 加10mL DMEM培养液，用吸管抽吸吹 打分散细胞，分装于2个培养瓶。在倒 置纤微镜下可见圆形细胞。放入细胞 培养箱中培养