度与毒性有所不同； ➢ 应用浓度为50%；
37
挑选阳性克隆 ➢ 细胞生长至一定数量后便可进行； ➢ 方法应敏感、简单、重复性好； ➢ 方法：
➢ RIA、 ELISA、FIA；
38
挑选阳性克隆 ELISA是常用技术之一
39
克隆化 ➢ 将阳性克隆与其它克隆分开的过程。 ➢ 克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢
实验流程
27
实验流程
细胞融合
克隆筛选
制备免疫脾细胞 培养骨髓瘤细胞
克隆化 细胞鉴定 大量制备
28
技术要点 ➢ 免疫脾细胞的制备 ➢ 骨髓瘤细胞的培养与筛选 ➢ 细胞融合 ➢ 阳性克隆的筛选 ➢ 克隆化 ➢ 大量抗体的制备
29
制备脾细胞 ➢ 选择合适的免疫方案是获得高质量的抗
体的前提； ➢ 一般要在融合前两个月左右确立免疫方
12
亲本细胞之一：免疫脾细胞 ➢ 被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆
细胞并分泌免疫球蛋白；
➢ 单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识 别并结合一种抗原表位，分泌单一特异 性抗体；
13பைடு நூலகம்
亲本细胞之一：免疫脾细胞
采用BALB/c小鼠
14
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 ➢ 选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株； ➢ 能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，
失。方法有： ➢ 显微操作法 ➢ 有限稀释法 ➢ 软琼脂法
40
应用有限稀释法进行克隆化
➢ 不需任何特殊设备 ➢ 克隆出现效率高 ➢ 实验室常用方法
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细胞鉴定 ➢ 特异性 ➢ Ig类与亚类 ➢ 中和活性 ➢ 染色体核型 ➢ 识别抗原表位 ➢ 亲和力
42
大量制备抗体 体外细胞培养 腹腔内培养
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大量制备抗体
腹腔内培养
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实验流程 体外细胞培养
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实验流程
注意： 阳性细胞克隆的冻存与复苏
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问题四:
单克隆抗体的优缺点
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单克隆与多克隆比较
POLYCLONAL.
Derived from different B Lymphocytes cell lines
Batch to Batch variation affecting Ab reactivity &
并分泌免疫球蛋白； ➢ 骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白； ➢ 具有较高融合效率；
15
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
SP2/0细胞
➢ 容易培养传代， 一般培养基即 可，无特殊要 求。
NS1细胞
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亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
Sp2/0为悬浮型细胞
17
细胞融合
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细胞融合 ➢ 化学法 ➢ 物理法 ➢ 生物法
SPLEEN CELLS
PEG FUSION
MYELOMA CELLS
Feeder Cells Growth Medium
1.
HYBRIDOMA CELLS ELISA PLATE 2. HAT Medium
Plating of Cells in HAT selective Medium
Scanning of Viable Hybridomas
5
克隆选择学说
6
克隆选择学说
淋巴细胞不能在体外长期存活
7
杂交瘤技术
杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性
8
杂交瘤技术的创始人
9
杂交瘤技术 1984 荣获诺贝尔生理医学奖
杂交瘤技术是制备抗体的技术革命
10
问题二:
杂交瘤技术的基本原理
11
两个基本问题 选择亲本细胞与细胞融合
应用选择培基与杂交瘤细胞筛选
Enable the development of secure immunoassay systems.
案开始初次免疫； ➢ 免疫方案应根据抗原的特性不同而定；
30
制备脾细胞
31
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧
失酶的缺陷； ➢ 为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每
3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次， 以防止细胞的突变；
32
培养筛选骨髓瘤细胞
Myeloma Cells
➢ 单克隆抗体具有均一性，推动商品化试 剂盒出现和发展；
➢ 单克隆抗体出现推动T细胞亚群研究； ➢ 单克隆抗体推动生物制药领域的发展；
3
问题一:
制备单克隆抗体的理论基础
4
克隆选择学说
➢ 1857年，FM Burnet 提出克隆选择学说。 指出：每个B淋巴细 胞表面的抗原受体只 识别一种抗原表位， 并产生针对该决定簇 的抗体。
titre
NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests
MONOCLONAL.
Derived from a single B cell clone
mAb offer Reproducible, Predictable & Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity
PEG （聚乙二醇）为最常用的融合法
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细胞融合
20
选择培养基 ➢ 基本成分
➢ 次黄嘌呤（H） ➢ 氨基蝶吟（A） ➢ 胸腺嘧啶（T）
HAT选择培养基
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选择培养基作用原理 为何使用选择培养基？
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选择培养基作用原理
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选择培养基作用原理
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问题三:
杂交瘤技术的实验流程
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实验流程
26
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细胞融合 ➢ 杂交瘤技术中最为关键一步； ➢ 融合前亲本细胞需经预处理；
➢ 融合37℃水浴中进行；
➢ 注意两种亲本细胞的比例； ➢ 选择高质量细胞融合剂； ➢ 缓慢终止融合作用；
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关于“PEG” ➢ 分子量1500-3000 道尔顿； ➢ 诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细
胞膜易打开而有助于细胞融合； ➢ 不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯
+ 8 - Azaguanine
Myeloma Cells
HGPRT-
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培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ 使用对数生长期细胞，融合前进行换液，
确保细胞处于最佳状态。 ➢ 培基：RPMI1640，DMEM培养基。小
牛血清的浓度一般在10～20％ 。 ➢ 一般在准备融合前的两周就应开始复苏
骨髓瘤细胞 。
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细胞融合
单克隆抗体制备技术
李会强 教授
1
何谓单克隆抗体？ ➢ 单克隆抗体（ monoclonal antibody，
McAb）是指由单个杂交瘤细胞增殖而 成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表 位的、完全均一的、单一特异性的抗体。
2
单克隆抗体的出现对医学发展的影响
➢ 单克隆抗体具有很高特异性，增加检测 方法的特异性；