荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体 荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体
荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体
Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体
扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆 形颗粒为支原体
支原体的清除
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支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法 支原体清除剂 ） 天换一次液， 每4天换一次液，连续处理 天 天换一次液 连续处理15天 清洗纯化法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选 细胞清洗→反复离心洗涤 优质细胞群的筛选→细胞清洗 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生， 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通 过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 药物辅助高温处理法 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时 小时， 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在 ℃培养 小时，可杀 死支原体，但对细胞有不良影响。 死支原体，但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法 的兔支原体免疫血清可去除支原体污染， 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原 的兔支原体免疫血清可去除支原体污染 体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性 并且5个月后仍为阴性 天即转为阴性， 个月后仍为阴性。 体生长，故经抗血清处理后 天即转为阴性，并且 个月后仍为阴性。
生长特点 排列成放射状， 排列成放射状，漩涡状 放射状 并不紧靠连成片， 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而 细胞 细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 游离的单独的成纤维样细胞， 单独的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起 常有几个伸长的细胞突起
培养细胞形态不稳定 血清 Hela pH Hela 高血清 低血清
分类 根据形态大致的不同，主要 类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮样 成纤维细胞样 其它， 其它，不定型
上皮样细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞 来源：来源于外胚层， 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺， 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞 形态：类似体内的上皮细胞 体内的 扁平，不规则多角形， 扁平，不规则多角形，中有圆形核
优点 生存空间大， 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化 传代方便 不需消化) 不需消化 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞 很多细胞不能悬浮生长 尤以正常细胞) 尤以正常细胞
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡， 细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液 清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明 生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可 能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之， 则较差或已死亡。由于培养基内有 pH 指示剂的存在，因此 它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时， 细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过 长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞 生长状态不好，或已死亡。
2．细胞活力 ． ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
Hemocytometer Cell Counts
Hemocytometer
The most common routine method for cell counting which is efficient and accurate is with the use of a hemocytometer.
支原体污染
95％以上是以下四种支原体： 95％以上是以下四种支原体：
•口腔支原体（M.orale） 口腔支原体（ orale） 口腔支原体 •精氨酸支原体（M.arginini） 精氨酸支原体（ arginini） 精氨酸支原体 •猪鼻支原体（M.hyorhinis） 猪鼻支原体（ hyorhinis） 猪鼻支原体 •牛莱氏无胆甾原体（idlawii） 牛莱氏无胆甾原体（ laidlawii） 牛莱氏无胆甾原体
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真菌污染
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作 用而使细胞脱落死亡。
细菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。（当在无血清培养基中添 加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度 的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血 清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到 毒性水平）。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗 法，于加药后作用24～48小时再换常规培养液。此 法在污染早期有效。
成纤维细胞样
太酸或太碱
上皮样细胞
标准pH 标准
成纤维细胞样
细胞密度 3T3 生长状态改变 悬浮或贴附 转化与否 低密度
上皮样细胞
高密度
成纤维细胞样
悬浮
上皮样细胞
贴附
圆形
未转化
成纤维或上皮样
转化后
成纤维样
可成上皮样
悬浮生长型
概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源自血，脾或骨髓， 来源自 脾或骨髓， 特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形， 细胞圆形，单个或小细胞团 圆形 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能
细胞污染
细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除
细菌污染
细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰 氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
⑦染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝染液可 以将死细胞迅速地染上蓝色，再延长时间则活细胞也将逐渐着色。
细胞增殖实验（ 细胞增殖实验（MTT法） 法
(一)原理 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑蓝）为 基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作 用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶， formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥 珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan 结晶可以用DMSO来溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光 密度OD值，以反映出活细胞数目。
支原体污染检测
荧光染色法 电镜检查：扫描电镜、透射电镜 电镜检查：扫描电镜、 支原体培养 聚合酶链反应(PCR)法 法 聚合酶链反应
支原体污染表现
细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓， 细胞营养液常常仍清亮但变黄 细胞生长变缓，部分细胞发 细胞生长变缓 生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。
1 mm 0.1 mm 1 mm Volume : 0.1mm3 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3
Dead cell
细胞计数及活力
细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当， 200 /10mm2 500 /10mm2 需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖 片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后, 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长， 一固相表面才能生存和生长，因而 属于粘附型细胞。 属于粘附型细胞。 粘附(锚定或锚着)依赖型( 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 细胞： 生存的细胞
类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 细胞在体内、 粘附方式： 方式 体内：粘附是 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 外形具有复杂的立体特征 具有 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般 一般与体内时明显不同 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
贴壁(粘附) 贴壁(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内 粘附:是大多数有机体细胞在体内 细胞 生存和生长发育的 生存和生长发育的基本存在方式 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 粘附于一固相表面 于一 才能生存和生长。 才能生存和生长。 生存