实验二实验器具的灭菌一、实验目的1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。

2.了解其他灭菌方法。

二、基本原理高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。

其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

三、器材1、高压蒸汽灭菌锅2、牛皮纸3、棉绳4、仪器和其他用具四、操作步骤1、包扎将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。

2、加热烧开待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。

3、升压完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。

4、减压，取出器具到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。

当压力降到零后，才能开盖。

五、思考题（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制—、目的要求1、明确培养基的配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。

二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0gNaCI 5.0g水1000mIpH 7.4～7.6三、器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。

2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。

牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

（蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。

瓶盖也不要盖错。

）2、溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。

将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。

在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。

3、调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。

反之，用1mol/LHCl进行调节。

4、分装按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。

5、加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

6、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

7、灭菌将上述培养基以0.103Mpa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

8、搁置斜面和倒平板将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜，冷凝；倒入平板适当量培养基，冷凝。

9、无菌检查将灭菌培养基放入37℃的温度中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。

五、思考题你认为在加热融化琼脂的过程中应注意哪些环节？实验四微生物的接种和培养一、实验目的1、掌握各种接种方法。

2、掌握无菌操作基本环节。

二、基本原理微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。

在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。

微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。

然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。

三、器材1、恒温培养箱。

2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。

3、培养基（上次实验配制的）。

4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。

四、操作步骤1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。

（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。

（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。

（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。

（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。

从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。

有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。

（9）将接种环烧红灭菌。

放下接种环，再将棉花塞旋紧。

2、穿刺接种把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。

（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。

（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。

3、液体接种（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。

接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。

（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管或滴管。

接种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀即可。

五、思考题（1）接种前和接种后为什么要灼烧接种环？（2）为什么要接种环冷却后才能用其与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上待其冷却？你怎样才能知道它是否已经冷却？附一无菌操作环节（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。

每次使用前，均应用紫外灯灭菌。

定期对接种室作无菌程度的检查。

（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。

工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。

不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。

（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。

移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。

（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。

（5）培养箱应经常清洁消毒。

附二接种室的消毒方法1、紫外线灭菌接种室使用前打开紫外灯照射约30分钟，就能使空气和室壁表面基本上无菌。

为了加强灭菌效果，在开灯以前可以在接种内喷洒石炭酸溶液，使空气中附有微生物的尘埃降落，并杀死一些微生物。

接种室的台面等，可以用2-3%的来苏尔擦洗。

紫外线对人体皮肤，尤其对眼睛具有杀伤力，因皮不要直视开着的紫外灯，也不能在开着灯的情况下工作。

2、喷洒石炭酸将石炭酸水浴，稍热，使之溶解。

用吸耳球通过吸管吸取该溶液，配成5%溶液。

对于小房间，可用喷雾器由上至下、由里至外顺序进行喷雾，并门，稍等片刻即可使用。

石炭酸对皮肤有较强的毒害作用，使用时不要接触皮肤。

3、福尔马林熏蒸（1）用量：市售福尔马林是37-40%的甲醛水溶液。

常用量按每立方空间2-6ml计算。

（2）熏蒸方法：用福尔马林熏蒸有两种方法：①加热熏蒸：按熏蒸空间计算,量取甲醛溶液,放在酒精灯上方的小铁筒或烧杯中,点燃酒精灯,关闭室门。

酒精灯最好在甲醛蒸完后即自行熄灭。

②氧化熏蒸：在一瓷杯里铺一张报纸，放入高猛酸钾（其用量为1/2甲醛量），再取定量的甲醛溶液，倒在盛有高猛酸钾的容器里，立即关门。

几秒钟后，由高猛酸钾氧化甲醛反应所产生的热将其余的甲醛蒸为气体。

由于甲醛对人眼、鼻有强烈的刺激作用，熏蒸后相当时间内不能进入室内工作。

因此，接种室至少在使用前24小时进行熏蒸，房间应密闭，保持12小时。

之后可取与甲醛等更是的氨水，倒在一个瓷碗里，放入熏蒸过的接种室，以减少甲醛对人的刺激作用。

用氨水中和，至少应在工作前2小时进行。

4、过滤除菌近几年来，多采用一种称之为超净工作台的接种室，其原理是借助于一鼓风机将普通空气鼓入，通过粗滤、超滤纤维过滤后，进入工作台内的空气即为无菌空气。

整个工作室内要求清洁无尘，这样可延长超净工作台的使用寿命。

新的超净工作台使用前，要进行无菌试验，确定合格方可使用，接种前，应先将工作台开启5-6分钟。

附三接种室无菌程度检查取无菌的营养琼脂平板，在接种室内台上和台下各放一套，把皿盖打开15min，然后盖好，倒置37℃恒温培养24-28小时，如果每个皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落很多，则应对接种室进一步灭菌。

实验五稀释涂布平板菌落计数法－、目的的要求学习平板菌落计数的基本原理和方法二、基本原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单落菌也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。

因此平板菌落计数的结果往往偏低。

为了清楚地阐述平板落计数的结果，现在已使用菌落形成单位（coIony—forming units,cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因数的影响，但是，由于核计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。