技术原理：
表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
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TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
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ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基；
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列；
• 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
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具专利保护的克隆构建系统
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具专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
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具专利保护的克隆构建系统
步骤二：TALEN表达质粒构建
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真核表达TALEN质粒对
在线靶点选择设计软件：https:///node/add/talef-off/
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TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元 为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD）
• RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确
同源重组发生率升高几个数量级
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TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
经典方法 ：
自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
饱含希望与失望的技术：
ZFN，被Sigma公司垄断
新的里程碑：
TALEN
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TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。
4. TALEN真核表达质粒转入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白
5. 检测突变效率，筛选（ 移码）突变体
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X2 X2
Mut
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选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82.
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崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN
经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout）
• 片段删除
• 片段插入
目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
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5
靶向基因技术
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
• 一篇综述
《Move over ZFN.》
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TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模表达质粒构建
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
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TALEN 发展过程
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TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
切割诱发DNA损伤修复机制
（nonhomologous end-joining，
NHEJ）。由于在此修过程中总是
• 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
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2
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因 敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达 到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
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3
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由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对 应识别一个目标碱基
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人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
…… 14 – 18个重复 真核表达
34氨基酸单元
…… 14 – 18个重复
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
有一定的错误率存在。在修复中发
生移码突变错误的个体即形成目标
基因敲除突变体
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TAL 靶点识别模块
X2
FokI
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TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid