验证文件大豆磷脂微生物限度检测方法验证起草人起草日期审核人审核日期批准人批准日期文件编号目录1适用范围 ....................................................................................................................... - 1 - 2目的 ............................................................................................................................... - 1 - 3概述 ............................................................................................................................... - 1 - 4验证所需要的仪器设备及文件 ................................................................................... - 1 - 5可接受的限度范围标准 ............................................................................................... - 2 - 6测试方法 ....................................................................................................................... - 5 - 7异常情况处理 ............................................................................................................. - 15 - 8测试结果 ..................................................................................................................... - 15 - 9结论 ............................................................................................................................. - 15 - 10再验证周期 ............................................................................................................... - 16 - 11附表 ........................................................................................................................... - 16 -1适用范围本验证方案适用于大豆磷脂微生物限度检查法的验证。

2目的建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。

3概述3.1按《中国药典》2010年版附录Ⅺ J《微生物限度检查法方法》的“供试品的制备”项下制备方法2（固体、半固体或黏稠液供试品，取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀,作为供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀）制备。

按“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法1平皿法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证。

按控制菌的检查法进行控制菌检查法验证。

验证试验使用一批产品进行三次独立平行试验。

3.2验证时间：年月日到年月日3.3验证产品批号：4验证所需要的仪器设备及文件4.1验证需用仪器设备4.2验证所需要的文件及存放地方5可接受的限度范围标准5.1大豆磷脂微生物限度检查质量标准5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。

若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

5.3控制菌检查方法验证结果判断若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。

5.4大肠埃希菌检查结果判断如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24h。

若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。

若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。

当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验M U G 呈阳性，供试品M U G 阳性、靛基质阳性，报告lg 或l m l 供试品检出大肠埃希菌。

M U G 阴性、靛基质阴性，报告lg 或l m l 供试品未检出大肠埃希菌。

M U G 阳性、靛基质阴性、I M V i C 试验为一+ ——、革兰阴性杆菌，报告lg 或l m l 供试品检出大肠埃希菌;M U G 阴性、靛基质阳性、I M V i C 试验为+ + — —、革兰阴性杆菌，报告l g 或l m l 供试品检出大肠埃希菌。

供试品培养物检查不符合二项中的任一项，报告l g 或l m l 供试品未检出大肠埃希菌。

当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌，不能做出检验报告。

5.5沙门菌检查结果判断供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阳性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阳性反应），报告10g 或10ml 供试品检出沙门菌。

供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应及沙门菌属0 多价1 血清凝集试验为阴性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阴性反应），报告lg 或lml 供试品未检出沙门菌。

供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进一步鉴定后，再作报告。

供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阴性反应。

供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集反应呈阳性反应。

对已检出沙门菌的供试品分离菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。

根据检出菌的特性,推断可能菌型，增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“0”及“H ”凝集试验进行鉴定。

5.6铜绿假单胞菌检查结果判断供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告lg或lml供试品检出铜绿假单胞菌。

供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告lg或lml供试品检出铜绿假单胞菌。

凡与以上两种结果不符时，报告lg或lml供试品未检出铜绿假单胞菌。

5.7金黄色葡萄球菌检查结果判断如果革兰染色镜检结果清晰可靠(必要时加做已知革兰染色镜检结果的细菌进行染色质量控制），凝固酶试验阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：疑似菌革兰染色镜检呈阳性球菌,血浆凝固酶试验阳性反应者，报告lg或lml 供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种）。

革兰染色镜检镜检不是革兰阳性球菌,或血浆凝固酶试验阴性反应，报告lg 或lml供试品禾检出金黄色葡萄球菌。

阴性对照有菌生长，试验结果无效。

阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌活性。

6测试方法6.1供试品大豆磷脂，批号。

6.2培养基及菌种6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。

6.2.2 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003、乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094、铜绿假单胞菌CMCC(B)101046.3菌液制备6.3.1细菌、霉菌及酵母菌检查的菌液制备6.3.1.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经30～35℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

6.3.1.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，经23～28℃培养24～48h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经23～28℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。

然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

6.3.2控制菌检查的菌液的制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许，接种至10 ml营养肉汤培养基内，置30〜35℃培养18〜24h，取均匀培养物lml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每lml含菌10〜lOOcfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。

6.3.3供试品制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。