110 bp和21 bp的片段,由于21 bp片段的分子量较小,在琼
脂糖凝胶电泳中难以显示,所以当受检个体为野生型纯合子
时,酶切产物可见110 bp一条带;如为突变纯合子,则不能
被NsiⅠ酶切,电泳图上只有131 bp的片段;如为杂合子,则
显示110 bp、131 bp两条带。本文检测了151例口服华法林
为Leu,导致该处的一个限制性内切酶Nsi I位点的丢失。国外
基金项目:深圳市科技和信息局资助(200602119)
作者简介:霍梅(1970- ) ,女,硕士,副主任技师,研究方向:血液
学检验
作者单位: 1.暨南大学医学院附属二院深圳市人民医院检验科; 2.暨
南大学医学院附属二院深圳市人民医院心外科; 3深圳市
人民医院临床医学研究中心; 4.广东医学院检验系实习生
研究表明携带CYP2C9*2和*3的个体,影响华法林的代谢,
使个体间华法林的剂量相差较大,国内关于口服华法林抗凝治
疗患者CYP2C9基因多态性的分布特点研究较少,本文检测了
151例口服华法林抗凝治疗患者CYP2C9基因CYP2C9*1、
CYP2C9*2、CYP2C9*3的多态性,现报道如下。
华法林抗凝治疗患者CYP2C9基因多态性的研究
霍梅1,刘春1,杨超2,李体远3,龚亮4
摘要: [目的]研究深圳地区口服华法林抗凝治疗患者细胞色素P4502C9 ( CYP2C9)基因CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3多态性的特点。[方法]应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR- RFLP)检测151例口服华法林抗凝治疗患者CYP2C9基因CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3的多态性。[结果] 151例口服华法林抗凝治疗患者中未检测出CYP2C9*2等位基因, CYP2C9*1、CYP2C9*3等位基因的频率分别为92.7%和7.3%,CYP2C9*1*1、CYP2C9*1*3、CYP2C9*3*3基因型频率分别为85.4% (129)、14.6% (22)、0 (0)。[结论]深圳地区口服华法林抗凝治疗病人中存在CYP2C9*3突变基因,使用华法林抗凝治疗时应检测患者CYP2C9的基因型。
凝作用
[1]
,是广泛应用于临床的一种口服抗凝药,存在S-华法
林(左旋华法林)和R-华法林(右旋华法林) , S-华法林是消
旋华法林片剂的主要成分,人类对华法林的药物代谢也主要针
对S-华法林。华法林的代谢主要由一系列细胞色素P450酶催
化, CYP2C9是细胞色素P450酶的一种亚型,在人肝脏主要
由CYP2C9介导华法林的羟化代谢, CYP2C9基因具有遗传多
分析CYP2C9*3的PCR上游引物序列为5' -
TGCACGAGGTCCAGAGATGC - 3';下游引物序列为5' -
AAACATGGAGTTGCAGTGTAG - 3', PCR引物由上海生物工程
公司合成。PCR反应体系为25μl,含DNA模板3μl, 10 x
PCR缓冲液2.5μl, MgCl
3, 6是PCR产物,泳道2, 4, 7是对应的酶切产物, M是分
子量标志, 3个患者PCR产物酶切后均为520 bp和169 bp的
片段,均是野生型纯合子(CYP2C9* 1*1)。
2.1.2 CYP2C9*3的检测根据引物设计, PCR产物大小应为
131 bห้องสมุดไป่ตู้,如为野生型纯合子,则被限制性内切酶NsiⅠ切成
Abstract: [ Objective] To study on the feature of CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3 genetic polymorphisms of cy-tochrome P450 ( CYP2C9) in patients with warfarin anticoagulant therapy in Shenzhen area. [ Methods] The CYP2C9*1,CYP2C9*2, CYP2C9*3 genetic polymorphisms of cytochrome P450 (CYP2C9) were analyzed in 151 patients with warfarin an-ticoagulant therapy by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP). [Results] Therewere no CYP2C9*2 allele in 151 patients with warfarin anticoagulant therapy .The allele frequencies of CYP2C9*1, CYP2C9*3were 92.7% and 7.3% respectively. The genotype frequencies of CYP2C9*1*1, CYP2C9*1*3, CYP2C9*3*3 were 85.4%(129) , 14.6% (22) , 0 (0) respectively. [Conclusion] The CYP2C9*3 mutant is present in patients with warfarin anticoag-ulant therapy in Shenzhen area. CYP2C9 genotype should be analyzed when using warfarin anticoagulant therapy.
物序列为5'- CTAACAACCAGACTCATAATG - 3', PCR引物由
上海生物工程公司合成。PCR反应体系为25μl,含DNA模
板3μl, 10 x PCR缓冲液2.5μl, MgCl
2
3μl ( 25 mmol/L) ,
dNTP 0.2μl ( 10 mmol/L) , Taq DNA聚合酶2.5 U,上游引物
象与Hardy- Weinberg平衡( HWE)的符合程度采用χ
2
检验;
应用SPSS软件处理。P﹤0.05为有显著性差异。
2结果
2.1 CYP2C9基因多态性电泳结果
2.1.1 CYP2C9*2的检测根据引物设计, PCR产物大小应为
689 bp,如为野生型纯合子,则被限制性内切酶AvaⅡ切成
520 bp和169 bp的片段;如为突变纯合子,则不能被AvaⅡ
值见表2,经计算基因型分布符合Hardy- Weinberg平衡,Χ
2
=
1.099, P﹥0.05,表明调查人群实际检出基因型频率与预期频
率基本一致,具有群体代表性。
Key words: Warfarin; Anticoagulation; Gene; Polymorphism; Cytochrome P4502C9
华法林( warfarin)是香豆素的衍生物,它通过抑制维生
素K (Vit K)环氧化还原酶活性,阻止Vit K循环利用,并使
Vit K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ无法激活,从而发挥抗
抗凝治疗患者,检出了22例杂合子( CYP2C9 *1*3,但未检
出CYP2C9*3*3突变纯合子,见图2。
图2 CYP2C9基因多态性电泳结果(CYP2C9*3突变的检测)
图2为3个患者CYP2C9*3突变的检测结果,泳道1,
3, 6是PCR产物,泳道2, 4, 7是对应的酶切产物, M是分
子量标志,患者1和3是杂合子( CYP2C9 *1*3) ,患者2是
关键词:华法林;抗凝;基因;多态性;细胞色素P4502C9
STUDY ON THE GENETIC POLYMORPHISM OF CYTOCHROME P450 ( CYP2C9) IN PA-
TIENTS WITH WARFARIN ANTICOAGULANT THERAPY HUO Mei, LIU Chun, YANG Chao,et al. (People’s Hospital of Shenzhen, The Second Affiliated Hospital of Medical College, Ji’nan Universi-ty, Shenzhen 518020, China)
野生型纯合子(CYP2C9 *1*1)。
2.2 CYP2C9等位基因和基因型分布频率
由于本文未检测出CYP2C9*2等位基因,因此只计算
CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因及相应的基因型的频率,见
表1。
2.3 CYP2C9基因多态性Hardy- Weinberg平衡检验结果
由于本文未检测出CYP2C9*2基因,因此只对CYP2C9*1
含PCR产物10μl,限制性内切酶AvaⅡ( CYP2C9*2分析)
或NsiⅠ(CYP2C9*3分析) 1.5μl (15 U) , 10 x酶切缓冲液3
μl,混匀后置37℃消化4 h。用4.0%琼脂糖凝胶电泳, Gold
View核酸染料染色分析结果。
1.4统计学方法
应用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率,研究对
0.5μl ( 5μmol/L) ,下游引物0.5μl ( 5μmol/L)。Gene Amp
PCR System 9700型扩增仪(美国基因公司生产) ,循环参数:
94℃预变性5 min进入循环, 94℃变性20 s, 55℃复性10 s,
72℃延伸10 s,共35个循环,最后72℃延伸5 min。
2
2μl ( 25 mmol/L) , dNTP 0.7μl
( 10 mmol/L) , Taq DNA聚合酶1.0 U,上游引物1.0μl ( 5
umol/L) ,下游引物1.0μl (5μmol/L)。Gene Amp PCR System