5’ 3’
2n
24
3’ 5‘
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 5’ 3’ 3’
5’ 5’
3’ 3’
3’ 3’
5’
5’
.
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
25
PCR
PCR
PCR的衍生类型：
1. 反转录PCR 2. 原位PCR
3. 重组PCR 4. 不对称PCR
5. 多重PCR 6. 反向PCR
组织（如血液）中总RNA提取 RNA
反转录成cDNA
RNA cDNA
cDNA
利用HIV特异性引物进行 PCR
电泳检测预期条带的出现
.
600 bp
40
• 肿瘤
通过从基因水平检测细胞内可能导致肿瘤发生 的基因突变、扩增、重排、缺失，或mRNA水平 检测肿瘤细胞中特异表达的基因或基因表达量的 改变，对肿瘤进行早期诊断，并对肿瘤进行分类、 预后判断。
一、核酸分子杂交
原理：核酸的变性复性理论。
双链的核酸分子在某些理化因素（如高温等） 作用下，双链解开，待条件恢复时，又按碱基互 补配对规律形成双链结构。在这一过程中，不同 来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补配 对的碱基序列，即可形成杂合双链。
核酸印迹杂交：Southern blot, Northern blot
.
41
• 重大疾病的易感性
检测人类白细胞抗原基因等与疾病的易感性相关 的基因
• 器官移植组织配型
• 法医学 (个体识别、亲子鉴定、法医物证)
DNA 指纹：（1）RFLP （2）串联重复序列
.
42
.
43
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
.
20
基因芯片
(gene chip, gene microarray)
•生物芯片
DNA芯片、蛋白质芯片、组织芯片
•基因芯片技术 (一种高通量的固相核酸杂交技术)
将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有 序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交， 通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信 息（基因序列和表达信息）。由于常用计算机硅芯 片作为固相支持物，故名基因芯片。
➢单核苷酸多态性(SNP)
.
32
第二层次：诊断的目标
(检测遗传物质发生了什么变化 )
检测基因水平（有或无，量多少）、结构的变化
• 点突变: PCR/ASOH PCR/SSCP

.
33
杂交 M
M N
N
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
PCR/ASOH(等位基因特异. 的寡核苷酸探针杂交) 34
不对称PCR 电泳
Marker 正常 突变
.
35
PCR/SSCP(单链构象多态性)
• 大片段核酸片段的丢失或插入: 多重PCR
①
②
③
④
⑤
⑥
多重PCR
⑥ ⑤ ④ ③ ② ①
.
36
Marker 正常 缺失
• 基因重排检测: 荧光原位杂交技术（FISH） • 基因扩增: Southern 结合条带密度扫描 • 基因表达异常
将探针溶于杂交缓冲液 膜浸于其中进行杂交
转膜 杂交 结果检测
洗膜
缓冲液洗涤去除未杂交探针
.
14
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
同位素 放射自显影 荧光、化学发光 压X光片 生物素 酶标亲和素—底物显色 地高辛 酶标抗体—底物显色
.
15
.
16
点杂交（dot blot）
将RNA或DNA变性后直接点样于膜上， 再采用特定的探针进行杂交。
变可能影响单链核酸分子的构象，从而在非变性凝胶电泳 时表现出不同的迁移率，以此来检测核酸序列中的点突变 。
目前还没有确切的理论预测碱基突变、构象改变与电 泳迁移率三者的定量关系，因而SSCP仍然是经验技术。
.
31
➢串联重复序列多态性: 人基因组的非编码区存在大
量的串联重复序列，其中有些是以一系列短的重复序列排 列组成的高变区，称为数量可变的串联重复序列 (VNTR)。 在一些遗传病和多种肿瘤中都观察到重复序列的增加或丢 失。对这种串联重复序列的多态性进行分析，可用于疾病 的诊断。具体方法是：针对串联重复序列两侧的DNA序列 设计引物，用PCR扩增出这段重复序列，然后用凝胶电泳 对扩增出的序列进行长度分析。
7. 锚定PCR . 8. 巢式PCR
26
第一层次：基因诊断的基本方法
（用什么技术去诊断）
三、DNA序列测定
.
27
.
28
第一层次：基因诊断的基本方法
（用什么技术去诊断）
四、其他方法
• 限制性内切酶酶谱分析
一种检测特定位点基因突变的方法。当基因的突 变发生在某种限制性内切酶的识别位点时，用该限 制性内切酶消化该突变基因，并用探针通过核酸杂 交检测消化后的片段，将检测到与野生型基因消化 产物不同的片段组合，从而确定2个等位基因之一或 全部是否发生了某种突变。
高温DNA聚合酶： Taq酶
缓冲液：含Mg2+
H2O
.
反应过程：
（20-35个循环）
变性：95℃ 10-45s 退火：55-65 ℃ 10-30s 延伸: 72 ℃ 30-60s
23
3’ 5‘
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
2n
.
5’ 3’ 3’ 5’
如果基因的某一位点发生了突变，那么根 据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计并 合成两种寡核苷酸探针，一种与突变基因的 碱基序列互补（M） ，另一种与正常基因在 相应位点上的核苷酸序列互补（N），通过
杂交即可确定待检的2个等位基因是否有一个 或全部发生了突变。
.
19
M
杂交
N
M
N
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
4.在疾病尚无临床症状时作出早期诊断
5.检测样品获取方便，不受组织或时相限制
6.检测对象可以是自体基因或外源基因，适用于多种疾病的诊断
.
7
基因诊断的三个层次
• 基因诊断的基本方法
用什么技术去诊断
• 基因诊断的目标
检测遗传物质发生了什么变化
• 基因诊断的结论
确定得了什么病
.
8
第一层次：基因诊断的基本方法 （用什么技术去诊断）
转膜 杂交 结果检测
➢种类：DNA, RNA, 寡核苷酸 ➢标记物：
放射性核素，生物素，地高辛，荧光素 ➢制备方法:
(1)化学法 (2) 酶促法：
末端标记；切口平移法；随机引物法
.
10
探针的制备
样品的制备
电泳分离 转膜
组织中提取：
基因组DNA/限果检测
.
17
原位杂交（in situ hybridization）
• 菌落原位杂交用于基因克隆和基因的筛选• 组织细胞原位杂交
确定特定核酸序列在染色体上的定位； 组织细胞 中特定基因的表达水平（即相应mRNA的水平）
.
18
等位基因特异的寡核苷酸探针杂交
（allele specific oligonucleotide hybridization, ASOH）
基因诊断
Gene Diagnosis
.
1
实验室诊断技术
• 第一类实验室诊断技术
以细胞学检查为主，根据疾病所导致的细胞形态或 /和数量的改变提供诊断依据
• 第二类实验室诊断技术
通过分析代谢产物和酶的活性变化为诊断提供信息
• 第三类实验室诊断技术
以免疫学检查技术为主，通过识别特定蛋白质分子 的差异为诊断提供依据
硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 PVDF膜等
(1) DNA印渍技术：
Southern Blotting
(2) RNA印渍技术：
Northern Blotting
(3) 蛋白质印渍技术：
Western Blotting
.
13
探针的制备 样品的制备 电泳分离
预杂交 杂交
封闭样品中非特异性的结合位点 鲑精DNA、脱脂奶粉
• 外源基因的入侵
（感染性疾病）
.
5
基因诊断的定义与特点
• 定义：
利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测基因的存在、分析基因的结构变异和 表达状态，从而对疾病作出诊断。
.
6
• 特点：
1.直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强
2.应用PCR等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少
3.可以检测患病者，和致病基因携带者
斑点印迹杂交（Dot blot）
原位杂交（in situ hybridization）
.
9
基因芯片（gene chip）
探针的制备 样品的制备 电泳分离
探针（probe）——用放射性核素或其他标
记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷 酸），它具有特定的序列，能够与待测的核 酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样 品中的特定DNA或RNA。
.
21
应用基因芯片筛选差异表达基因
Cy3标记病变细胞cDNA （红色）
Cy5标记正常. 细胞cDNA （绿色）
两图叠加分析 22
第一层次：基因诊断的基本方法
（用什么技术去诊断）
二. 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)