菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2．2盐析根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C3000rpm离心6min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
2．3透析将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。
若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2．4酶活力测定方法取4支试管，设置1支为实验对照，3支为平行样品。
取0.1mL 酶液，加入0.9mL 激活剂，37℃预热10min ，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL ，准确反应10min ，加入10%三氯乙酸3mL 反应终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。
离心（3000r/min ，5min ）或过滤，清液于280nm 波长下测定光吸收值。
酶活单位定义：在上述条件下，每10min 增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U ）。
2.5蛋白质含量测定方法2.5.1标准曲线的绘制0~1000μg/mL 标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。
管号1234561000μg/mL 牛血清白蛋白（mL ）蒸馏水（mL ）蛋白质浓度（μg/mL ）01.000.20.82000.40.64000.60.8 1.00.40.206008001000得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL ，准确吸取各管溶液0.lmL ，加入5ml 考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min ，测定595nm 吸光值，绘制0-1000μg/mL 标准曲线。
2.5.2样品的测定准确吸取样品溶液0.1mL 放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm 。
3实验结果与分析3．1蛋白质含量计算由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL ），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
样品蛋白含量(μg/g 鲜重)＝────────────────────────────────────────3．2酶活力计算酶液活力（U/mL ）=×稀释倍数A 280nm0.001×0.1查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)样品重量(g)3．3酶比活的计算酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量3．4酶纯化过程中回收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100=〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100 3．5酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力3．6实验结果3.6.1蛋白质含量样品蛋白含量=758.2309μg/g（鲜重）3.6.2酶活力3.6.3酶比活3.6.4酶纯化回收率盐析回收率=40.53%；透析回收率=45.43%3.6.5酶纯化倍数盐析纯化倍数=3.022；透析纯化倍数=2.714菠萝蛋白酶分离纯化表4实验结论与讨论粗酶盐析和透析三个步骤中的蛋白质浓度来看，粗酶中的蛋白质浓度要低于盐析和透析后的酶液处理过的蛋白质浓度，但是蛋白质含量是粗酶最高，证明了实验步骤确实有效地提取出了菠萝蛋白酶。
但是盐析的蛋白质含量计算值比透析的少，原因可能是盐析出来的沉淀溶解的过程中沉淀不能完全溶解导致溶液中蛋白质较透析液少。
盐析和透析后的酶活力比粗酶的高。
在温度在大于50℃后,40min 后，菠萝果浸提液中菠萝蛋白酶的活性将明显损失[1]，可能因为酶浓度的不同，导致加热步骤总体积（mL）总蛋白质含量（mg）总活力（U）比活力（U/mg·蛋白）回收率（%）纯化倍数粗提取58.322.759.231*10^54.058*10^4——盐析16.410.84 3.741*10^53.450*10^440.53%0.8501透析19.811.214.194*10^5 3.741*10^445.43%0.9217速度不一致，因而盐析和透析的酶活力会比较高。
在实验范围内，Fe3+、Fe2+、Cu2+存在对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大,可能是与它们具有氧化还原性性有关[2]，所以在盐析之前，受金属离子影响，粗酶的酶活力和酶比活会较盐析和透析之后的酶活力和酶比活低。
但是实验结果发现粗酶的酶比活非常高，与理论应该出现的梯次上升不符，分析应该是粗酶活力测定的时候粗酶放置的时间比较久，影响了酶活性，第二个原因可能是底物浓度不足，盐析和透析步骤中的酶将底物分解完全，而粗酶因为酶含量较低并不能完全分解，导致计算的时候盐析和透析酶活力偏低，同时TCA的添加顺序也有一定影响。
硫酸铵固体加入法却不能保证所加入的2.43g固体硫酸铵全部溶解完全，结果得到的菠萝蛋白酶沉淀中就很有可能含有未溶掉的硫酸铵盐成分，从而使得沉淀的质量有所增加，而溶液加入法则是在先前完全溶解后再移取到菠萝汁里的，得到的菠萝蛋白酶中不会有未溶解的硫酸铵盐颗粒存在；再有，硫酸铵固体加入法不如其溶液加入法温和，固体加入法容易造成菠萝皮浸提液中局部硫酸铵盐浓度过高而导致部分菠萝蛋白酶失活，从而导致酶活回收率降低[3]。
在加入硫酸铵的时候使部分菠萝蛋白酶失活，导致回收率降低。
盐析的纯化倍数要比透析的纯化倍数高，因为盐析后的酶浓度会比透析的酶浓度高，所以就单位酶活力来说，盐析的比活会比透析的高，所以算盐析的纯化倍数会高。
思考题：1.酶的失活原因主要是金属离子的结合，高温，有机溶剂等逆环境的抑制，所以分离纯化的时候要注意不能用不洁净的仪器（盛装过PBS）来盛装酶液，不能靠近万用炉，不能用自来水作为透析液。
2.U/mL酶液：表示每单位体积样液中酶活力的情况，适用于表示液体酶中的酶活大小。
U/mg蛋白质：表示每单位质量样品中酶活力的情况，适用于含一种或多种蛋白质的样品中的酶活大小。
U/g鲜重或干重：表示每g原始样品中的酶活力的情况，适用于原始样品的酶活力表示。
U/g酶粉：表示每g酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。
3.盐析法，有机溶剂法，重金属法，生物碱法，其中盐析法可逆，重金属法有机溶剂法、和生物碱法不可逆[4]。
4.随着硫酸铵浓度的逐渐增大，盐析得到的菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大，当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯菠萝蛋白酶的酶活回收率最大，为83. 6%，往后开始逐渐减小，这与易元龙文献中报道中的相一致，当硫酸铵的饱和度越大时，菠萝皮浸提液的盐析效果越好[5]，所以取30%左右的最好。
参考文献[1]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4[2]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4[3]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月[4]田亚平，]生化分离原理与技术，化学工业出版社，2010[5][3]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月附菠萝蛋白酶实验原始数据粗液59.0mL离心液58.3ml盐析液57.3ml+10.08g硫酸铵透析前离心沉淀溶解16.4ml透析液19.8ml蛋白质吸光值粗酶0.315盐析0.505透析0.440吸光值粗酶盐析透析对照0.5430.3780.389 1号 1.983 2.781 2.543 2号 2.230 2.730 2.589 3号 2.166 2.466 2.389。