转基因动物的制作方法
1. 原核期胚胎的显微注射 2. 逆转录病毒载体感染
3. 精子载体法4. 胚来自干细胞技术30转基因动物研究的应用
1. 基因功能与调控的研究 2. 建立人类疾病的动物模型 3. 生产药用蛋白 4. 提高畜产品产量、改善产品品质 5. 动物抗病育种 6. 异种组织和器官移植
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重组人类药用蛋白在动物乳腺中的表达
基因工程制药中常用的载体
质粒
存在于微生物细胞内染色体外的小型闭合环状双链DNA分子 理想制粒载体特性 有复制子 选择标记 强启动子 尽可能小 多克隆酶切位点
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抗药性质粒可在细菌间传递
抗药基因
质粒
mRNA
抗药性菌株
质粒可进出宿主细胞
抗药酶 水解抗生素
抗药性新菌株
非抗药性菌株
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转基因技术的概念
DNA
CsCl ultracentrifugation
plasmid RNA
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基 因 具工 酶程 及制 分药 子中 载常 体用 的 工
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工具酶 酶类型
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
作用
切割DNA
生成3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
探针标记、补平3′末端
34 成都地奥
基因工程药物
特性 功能
是一种非糖基化多肽激素 刺激身体生长
hGH
Genentech
枯草芽孢杆菌
适应症
侏儒症
Cellteck
哺乳动物细胞
Novo Nordisk
Bio Technology
Serono
长春高新
金塞药业
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基因工程药物
特性 功能
是一种蛋白质
IFN
北京三元
天津立达
广谱的抗病毒活性、抗细胞分裂和调节免疫
老张的儿子觉得老张精神不大好，赶紧带他去医院做全面检查，基 因检测结果发现，老张的肝细胞也发生了癌变，立刻住院治疗。
治疗的效果相当好，没过多久就可以出院了。 医生说，还好发现得及时，要不然也很麻烦。 这时传来了老友去世的消息，老张不禁慨叹人生事变化无常，令人 唏嘘。
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DNA取样
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细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态
二、转化及转染、转导作用 转化作用
把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程 称为转化
转染作用
重组噬菌体或病毒DNA直接引入受体细胞的过程
转导作用 病毒、噬菌体介导（有蛋白质外壳包装）
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(五)重组体的筛选和鉴定 1.直接选择法
抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 α —互补蓝白斑筛选 分子杂交 探针 原位杂交 Southern印迹法 限制性酶切图谱/PCR
2
3
现代生物技术包括：
基因工程、细胞工程、酶工程、微生物发酵工程、生物电 子工程、生物反应器、灭菌技术及新兴的蛋白质工程等，其 中，基因工程是现代生物工程的核心
人类60％以上的生物技术成果集中应用于医药工业，用以 开发特色新药或对传统医药进行改良，由此引起了医药工业 的重大变革，生物技术制药得以迅速发展 生物工程药物主要包括三大类：基因工程药物、生物疫苗 和生物诊断试剂。其在诊断、预防、控制乃至消灭传染病， 保护人类健康延长寿命中发挥着越来越重要的作用。
转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分 离到的目的基因，通过各种方法转入生物体内，如 动物、植物等。被转入的基因通过目前还不明了的 机理整合到被转入生物体的染色体中并能稳定地遗 传给下一代。这种被转入的基因即称为转基因。而 获得外来基因的生物体就被称为转基因生物体，如 转基因植物、转基因动物等。
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Insulin
维持血糖恒定，调控细胞内多种代谢途径
适应症
糖尿病
Eli Lilly
rA + rB 化学合成 Novo Nordisk rInsulin
胰岛素原
酶法
Insulin
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基因工程药物
特性 功能
是一种糖蛋白 刺激红细胞分化增殖
EPO
适应症
多种贫血
Amgon 瑞士罗氏 南京华欣 沈阳三生
Ortho 日本麒麟 华药金坦
是一种HBV抗原蛋白 刺激机体产生HBV抗体
重组乙肝疫苗
适应症
预防乙肝
华北制药 长春生物 天坛生物 深圳康泰 Merck Amgen
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基因工程药物
其它
心钠素
SOD
抗血友病因子 凝血因子
表皮生长因子 链激酶
基因工程抗体
其余基因工程疫苗
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生物诊断试剂
DNA诊断 基因诊断
基因诊断—用分子生物学的技术对引起疾病 的原因--遗传基因,致病微生物和寄生虫,以 及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和 细胞遗传基因的检测和分析.
基因工程制药中常用的载体 分子载体
种 类 用 途
作为外源基因的运载体，在细胞内可进行自我复 制的DNA分子，又称为无性繁殖载体。
克隆载体
表达载体
质粒
λ噬菌体
粘粒
M13噬菌体
动植物病毒
特点：带表达构件—转录和翻译 所需的DNA序列 含启动子—核糖体结合位点—克 隆位点—转录终止信号 – 启动子：trp-lac(tac)启动子、 λ 噬菌体PL启动子、T7噬菌体 启动子 – 核糖体结合位点(ribosomebinding site,RBS)：起始密 码子(ATG)和S测法
cDNA克隆的同胞选择法
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(二)克隆载体的选择和构建 (三)外源基因与载体的连接（DNA连接酶） 连接方式 1. 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 配伍末端 2.平端连接 连接效率低 3.同聚物接尾法 4.人工接头法
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(四) 重组DNA导入受体菌 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理
DNA/RNA产前诊断、携带者测试、症候前 诊断、遗传病易感性等
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情景一
你去应征一份高薪的好工作，且在面试的过程，你表现得很好。 过几天，你去理发，理发师用力梳理你的头发。当你走出理发店后， 有一个人进来，给这位理发师一些钞票，然后用一个袋子装入你掉在 地上的头发。 再过几天，你接到通知，不被录用。 因为在你的头发细胞中侦测出有基因上的缺陷。
情景二
你有一个美丽善良的妻子。
你还有一个高薪而稳定的好工作，事业蒸蒸日上，生活幸福美满。
就缺一个孩子，等了好多年，妻子终于怀上了小宝宝，你好开心。 在一次产前检查中，医生却告诉你最好不要生下这个小孩。
因为基因检测的结果发现小宝宝基因有缺陷。
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情景三
年纪大了，老张觉得身体不如以前了。 昨天听到了一个消息，几十年的老友得了肝癌，因为发现得太迟， 已经到了晚期，最多还能活三个月。
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基因工程药物无性繁殖系的组建化学合成法 构建基因法 √目的基因的制取 √ √
酶促合成法
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目的基因的制取
限 制 酶构建基因（染色体）目标基因限 制 酶
染 色 体
重组 基因
质粒载体
宿主菌
1 plasmid 1 cell
重组质粒 转入宿主
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目的基因的制取构建cDNA（反转录法或酶促合成法） 步骤 真核细胞总RNA的分离 mRNA的分离纯化 在逆转录酶和Oligo dT存在下 合成cDNA第一链 酶促合成cDNA第二链 连接酶切位点并酶切 重组到酶舟 上海三维 顺德南方 里亚哈尔
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基因工程药物
特性 功能
是一种非糖基化蛋白
TNF
直接杀死肿瘤细胞，调节免疫
适应症
肿瘤、癌症
复星实业
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基因工程药物
特性 功能 适应症
是一种丝氨酸蛋白酶 激活纤溶酶，溶血栓 心肌梗塞等血栓类疾病
tPA
九发股份 湖北科亮
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基因工程药物
特性 功能
第十四章 生物工程药物：
现状与未来
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一、 前 言
在现代生物学发展伊始，就曾有科学家预言， 21世纪将是生物技术主宰的世纪。然而，相当多的 人们并没有意识到这句话的含义。直到 1997 年 3 月， 一个名叫“多利”的小羊诞生被新闻媒介公布后， 人们才第一次严肃地关注起当今生物技术来，谈论 着生物技术能给人类带来些什么……
毫克/升 1.0 克/升 4.0 克/升 0.7 克/升 0.45
绵羊
山羊
猪
牛
0.025 微克/升 0.3 克/升 5.0 克/升 35.0 克/升 6.0 克/升 14 克/升 20 克/升 10 克/升 1 克/升 0.75 克/升 3 克/升 2.4 克/升
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基因工程药物
特性 功能
是一种多肽激素
动物品种 兔 启动子 兔ß－酪蛋白 牛α S1 －酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 山羊ß－酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 小鼠 WAP 绵羊ß－乳球蛋白 小鼠 WAP 人α －乳蛋白 蛋白质 hIL 2 hIGF-1 h α1AT hPC hfIX hPC hfribrinogen h α1AT htPA hATIII h α1AT Anti-cancer Mab hPC hPC hfVIII ha-lac 表达浓度
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生物工程药物特点
•高风险。 •高收益。生物工程药物的利润回报率很高。一种新生物药 品一般上市后2-3年即可收回所有投资，尤其是拥有新产品、 专利产品的企业，一旦开发成功便会形成技术垄断优势， 利润回报能高达10倍以上。
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二 、 基 因 工 程 药 物 及 其 产 品
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基因工程技术
从生物细胞中获得目的基因，并将此目 的基因插入载体，拼接后（重组）转入新的 宿主细胞，构建成工程菌、细胞及转基因动 物，实现遗传物质的重新组合，并使目的基 因在工程菌、细胞及转基因动物内进行复制 和表达的技术。