(三)PCR扩增产物污染 这是PCR反应中最主要最常见的污染问 题.因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检 测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性.
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染 的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就 可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管， 开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形 成气溶胶而污染. 据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而 由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
l PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg2＋ dNTP 耐热聚合酶 ddH2O
(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染是造成假阳 性反应的主要原因，但样品间的交叉污染 也是原因之一。 因此，不仅要在进行扩增反应时谨慎 认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有 环节都应该注意。
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
30
难 忘 的 1995 年 ------- 被 称 之 为PCR临床检验爆炸年？
天下大乱！ 到天下大治！
但令人头痛的问题是易污染，极其微 量的污染即可造成假阳性的结果。如果形 成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实 验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的 甚至要关闭PCR实验室。
仅含扩增反应混合液的对照管的功能： 1、监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污 染鉴别性。 2、如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或 多个空管打开静置于标本制备区30～60分钟， 然后加入扩增反应混合液，同时以水替代核酸 样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混 合液的对照管为阴性，则说明实验室以前扩增 产物的存在。
（四）污染的排除
在确定了污染的原因后，工作人员就开始着 手排除污染，每天都打开整个PCR实验室的门窗和 排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个 PCR实验室，打开所有的紫外灯照射。 每隔3 d按上述步骤检测一次，一直这样处理 了一个多月，A阴性对照才转为阴性。 连续检测三次A和B阴性对照,每次结果都均为 阴ห้องสมุดไป่ตู้,才确定PCR实验室恢复正常。
（二）阳性对照的设置 PCR反应实验室应设有PCR阳性对照，它是 PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎 理论要求的一个重要的参考标志. 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经 各种鉴定是该产物的标本，强阳性对照可产生大 量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染 源。 当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心 中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
该实验室用消毒液擦拭工作台面 后，打开所有的紫外灯照射一天，将 所使用微量进样器、离心管、枪头、 手套、记号笔、记录本等都更换掉， 再将HBV标本进行检测，结果全部标本 仍然为阳性。 第二天，仍然用消毒液擦拭工作 台面后，再打开所有的紫外灯照射一 天，将HBV标本重新检测，同时设置了 两个阴性对照(A和B)，
出现污染后，工作人员首先考虑可能 是试剂的污染，更换新批号的HBV试剂重新 检测后，结果仍然为全部标本阳性。 将HBV标本拿到其他正规的PCR实验室 检测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴 性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标 本没有被污染。 将两种批号的HBV试剂拿到其他正规的 PCR实验室检测，也显示试剂没有问题。
防止PCR实验室污染的方法
一． 污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些 操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或 杜绝污染的出现。 （一）划分操作区： 目前，PCR尚不能做到单人单管和实现完全闭 管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实 验操作在三个不同的区域内进行，各工作区要有一 定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他 两个工作区。
(一)标本间交叉污染: 1、收集标本的容器被污染； 2、标本放置时，由于密封不严溢于容器外； 3、容器外粘有标本造成相互间交叉污染; 4、标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪 污染导致标本间污染; 5、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或 形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
(二)PCR试剂的污染: 主要是由于在PCR试剂配制过程中，由 于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.
移液器污染是一个值得注意的问题. 尽可能用可高压处理的移液器，由于 移液器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污 染，最好使用可高压处理的移液器。
移液器的灭菌
Research移液器的下半部可拆卸下来经高温高压灭菌处理
n 121 °C，1 bar，20 分钟，灭 菌完毕后，在室温下完全晾干后 再 装上 n 10mL的移液器中的滤芯只能灭菌 一次，灭菌后略微有膨胀，但不 影响功能 n 所有的research移液器都可以 暴露于UV射线下
（二）污染的发现
2004年8月12日，该实验室按正常的操 作规程检测HBV DNA标本，同时设立了阴性 对照和阳性对照(均为试剂盒中配备)，扩 增结束分析结果时，发现HBV DNA所有的标 本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过 程中出现污染，但具体是什么原因引起的 污染还不清楚。
（三）污染源的追踪
PCR实验要分区进行： 所有的试剂准备在一个房间，在这个房间做 master mix，任何样本都不能带入这个房间。 所有的样本处理在另一个房间，做好master mix后在这个房间加样本。 PCR扩增反应另一个房间； PCR产物鉴定在另外一个房间。 所有工作按照这样一个顺序。
PCR反应中的对照： （1）只有master mix （2）将master mix中加入第一个房间里的水 （3）master mix中加入第二个房间的水 （4）master mix中加入处理样本时做阴性对照的水 （5）不加任何试剂和样本，只有相同体积的水。 如果（1）中有扩增条带，则是试剂污染，（2）或（3） 中有信号是各自房间中水污染，（4）中有信号是样本处理时 有污染，（5）中有信号是PCR反应过程中有污染（机器或反应 管），这样比较容易知道污染来源。
PCR实验室污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监 测，考虑有无污染、什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染.
PCR实验，不在于是不是能扩增出带来， 而是在于是不是有重复性、是不是有统计 性、有没有设对照，其实这3点做任何实验 都是必需的，尤其是对照，前两点对分析 单次实验结果可能影响不大，但对照就不 一样了。如果PCR有问题，没有对照很难分 析原因的，即便是PCR出的结果很好，没有 对照也无法说明是不是假阳性，关键还是 对照。
A对照：打开试剂反应管的盖 子，在空气中暴露10 min，盖上盖 子，上机检测； B对照：试剂的反应管不开盖 子，直接上机检测。 结果：全部标本和A对照为阳 性，而B对照为阴性。
至此，虽然还查找不到污染源是什么， 但有一点可以肯定，PCR实验室污染是气溶 胶扩散而引起的。 后来经过调查，发现污染是由于该实验 室新来了一个清洁工人，没有经过培训就直 接上岗，在打扫实验室卫生时，用扩增区的 扫笤和拖把打扫了标本制备区的卫生引起。
一次实验室污染的经历
某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所 幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实 验室污染排除掉了。
（一）实验室情况
l 实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增 区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标 本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩 增。 l 使用试剂 试剂是由中山大学达安基因股分有限公司提 供的乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR试剂。 l 操作人员 经过卫生部临检中心或省临检中心理论和操 作培训并通过考试取得合格证。
PCR实验室的污染与对策
河北医科大学第三医院
冯忠军
PCR技术是一种体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术，该技术通过 重复高温变性、低温退火、中温延伸 等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩 增数百万倍，获得极高的检测 敏感性。
30次循环后靶序列扩增的数量
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1
通常我们对PCR实验室污染的预防是采 取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验 操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭 或浸泡、紫外线照射等。而对于实验室的通 风方面没有给予足够的重视， 为了防止实验分区间之间的相互污染， 各个实验分区间都是尽可能的密闭，从而使 得实验室出现PCR产物残留污染的几率增大。
理想的PCR实验室设置
产物分析区 扩增区 标本制备区 试剂准备区
空气流向 空气流向
空气流向
空气流向
缓冲间
缓冲间
缓冲间
专用走廊
工作流向
各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作
（二）分装试剂：
PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的 超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加 样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增 后的DNA和其他来源的DNA： 1．PCR用水应为高压的双蒸水； 2．引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物 区 配 制； 3．引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时 间，以备发生污染时查找原因。
从本次PCR实验室污染排除的过程可以 看出，污染得以排除的一个关键是通风。 适当的给予实验室通风，可起到空气稀释 的作用，有利于PCR产物残留量的减少，加 快实验室污染的排除。 将该PCR实验室的教训报告给大家，是 想引起各位同行对实验室通风给予足够的 重视，不要再有类似的情况发生。
PCR实验室污染的原因
1 cycle = 2 Amplicon
2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
2 cycle = 4 Amplicon
2 3 4 5 6 20
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon