红外飞秒脉冲激光器
超短脉冲激光 »将高强度激光在压缩在极短的时间（飞秒）内发射
2004 Katashi Ishihara
红外飞秒脉冲激光器
1.2
重复频率F
峰 值 功 率 Ppeak 平均功率Pave
1
0.8
光强 P
0.6
脉宽τ
0.4
0.2
0
时间 T
2004 Katashi Ishihara
专为多光子优化而设计的光学部件
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
高密度光子发生的区域：物镜的焦点处 多光子激发只发生在物镜的焦点上，因 此激光只在空间的焦点汇聚,非焦点区 域由于光子密度不足以激发荧光，因此 不存在非焦面层的激发,所以不需要共 聚焦针孔，因而提高了荧光检测效率。
980nm 红外激光 脉冲
2004 Katashi Ishihara
1 photon
Excitation state
Excitation Light Excitation light
2 photon
Fluorescence
Fluorescence
Ground state
absorb one photon
Dr. S.Sekine, Dr. T.Shimizu
Tokyo Women's Medical University
30 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
多光子专用物镜——为优化多光子激发而设计
1) NA1.05:
2) FN27.5： 3) 2mm： 4)透过率： 5)盖玻片:
高分辨率，足够小的会聚焦点
充分收集散射荧光 长工作距离 从400nm-1000nm 校正环
6)光校对:
600-1000nm红外校对
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物镜根据盖片和标本厚度进行校准
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心脏(血管)
Rat Heart. Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin.
固定后未经冷冻处理
FV1000-MPE M system XLPLN25XSVMP
Imaging Area (Left Atria)
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什么是飞秒 ?
飞秒是时间度量单位
1秒 = 103毫秒 = 106微秒 = 109纳秒 = 1012皮秒 = 1015飞秒
光速=30万公里/秒
赤道长度 4万公里
光速在1飞秒的时 间内，可以传播 0.3um 不到头发 丝的1/100
2004 Katashi Ishihara
上海中科院神经所 杜久林 仪器：Olympus FV1000 MPE
2004 Katashi Ishihara
斑马鱼发育 xyzt
FUCCI (S-green;G1-red), Miyawaki, 2008
2004 Katashi Ishihara
多光子局限：
1）飞秒脉冲激光器，一个时间段只能出一条谱线。 多色荧光需要分时间序列采集 或选择两种染料的中间波长，同时激发（串色）
YFP-H Adult Mouse (13W) Cerebral Cortex-Hippocampus
1mm 2mm White Matter 3mm CA1
Hippocampus 4mm CA3 5mm 6mm Thalamus 7mm
Image data courtesy of:Hiroshi Hama, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics RIKEN Brain2014/12/8 Science Institute
2004 Katashi Ishihara
双光子同步多色
Single line image by 950nm
EGFP DsRed2
GFP
DsRed
Dual line sequential image by 940nm & 1040nm
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
About 400um depth is observed
Hiroshi Hama, Rie Ito, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
26 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
36 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
双光子同步多色
Single line image by 950nm
EGFP DsRed2
GFP
DsRed
Dual line sequential image by 940nm & 1040nm
FV1000 (SPE) UPLNSAPO30XS
能见约440um
Hiroshi Hama, Rie Ito, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
29 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
目的一：保护标本 目的二：看得深
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更深小鼠活体成像
麻醉小鼠从皮质表层到海马的CA1 区的3D重构.
标本：
Thy1-YFP H-line 雄鼠(8 周大) 物镜： XLPLN25XWMP
1300um
20
Image data courtesy of: Katsuya Ozawa RIKEN Brain Science Institute The image was acquired at RIKEN BSI-Olympus Collaboration Center 2014/12/8 No data copy / No data transfer
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
2 photon excitation absorption
The head of Zebra fish 8 days embryo: Endoccapillary cells （EGFP） and blood cells (DsRed) Image data courtesy of: Director Naoki Mochizuki Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center
在体鼠脑 xyzt
NIBS Dr. Luo Minmin Neuron & Science
IBP Dr. Liu Li / Wang Jinhui Science & JCS 2004 Katashi Ishihara
Hale Waihona Puke 脏 (血管)Mouse kidney. Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin. FV1000-MPE XLPLN25XSVMP zoom 2X
22
8mm
No data copy / No data transfer permitted
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在体小鼠免疫细胞迁移
Dr. Peace Xu, TSU
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清华大学祁海Nature文章
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permitted
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2P sample
1P normal sample
4mm & 8mm Special Objective + SCALEVIEW-A2 optimization
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Surface
Scale-view 处理的标本
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单光子 激光 扫描 共聚焦 显微镜 双光子 显微镜
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双光子优点：
1）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小； 2）长波长的光受散射影响较小容易穿透标本， 激发光可以穿透更深的标本；
3）只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 更适合用来观察厚标本、活细胞 或用来进行空间定点光漂白实验。
37 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
Thank you !!!
2004 Katashi Ishihara
about half energy (=double frequency) absorb two photons at once >300kW
< 100mW 100fs
2004 Katashi Ishihara
发生双光子现象的必要条件！！ 极大量的光子（峰值功率高），