• 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高 的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基， 如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加
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3‘端碱基要求
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5’端碱基要求
• 5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用 来引进修饰位点或标记物。
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∆G 值
• ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构 内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不 超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的 ∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反 应。（能值越高越容易结合）
• ∆G高于4.5时易引发产生引物二聚体和发夹结构
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发卡结构
• Hairpin • 一条引物自身碱基之间发生配对
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二聚体
• Dimer • 同一条引物的两条连之间发生碱基互补配对
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错配
• Fals priming • 引物与模板的发生配对的位置不止一个。尽管
只有某一处可以与引物完全配对吻合，但是其 它位置也可与引物之间发生不完全配对，影响 延伸。
PCR退火温度一般是55°，变性温度94°， Tm一般在58-70 °之间比较合适。
• 两个引物之间的Tm值应尽可能接近，不应超过4°
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3‘端碱基要求
• 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。 不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端 使用碱基A。
• 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于 16bp是必要的（不容易引起错配）。
• 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜 在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引 物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.
• 较长的引物（28-35bp) • 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些
突变位点
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GC%
• 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。
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Байду номын сангаас
Tm值
• Tm DNA溶解温度，即DNA的双链失去一半时的温度。 • Tm 值计算的经验公式 • Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) • 退火温度一般低于Tm，退火温度越高，特异性越高，但杂交率越低。
引物设计的一般原则
郭大伟
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引物设计的一般原则
1. 1.引物长度 2. 2.GC% 3. 3.Tm值 4. 4.3‘端碱基要求 5. 5.5’端碱基要求 6. 6.∆G 值
7.发卡结构 8.二聚体 9.错配
10.交叉二聚体 11.产物长度
12.评分
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引物长度
• 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大 于38。
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交叉二聚体
• Cross dimer • 两条引物之间发生碱基配对
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产物长度
• Product • 根据自己需要决定，但应尽可能长，这
样有利于保持其特异性。
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评分
• Rating • 单链评分 • 双链综合评分
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谢谢各位！
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