• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）、电泳介质
丙烯酰胺（单体） + 甲叉双丙烯酰胺（交联剂）
催化剂
三维网状结构的凝胶
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T=（a+b）/ m × 100% C= b /（a+b） × 100%
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③、电位梯度的不连续性
电泳开始后，由于Cl-的迁移率最大，很 快超过蛋白质，因此在Cl-的后边形成一个离 子浓度低的区域即低电导区。在低电导区就 有较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白 质和慢离子在快离子后面加速移动。
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④pH的不连续性
分离胶 12%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH8.8）
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1、原理
①、SDS + 蛋白质
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
1.4g 1g
SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，通 过断裂氢键，破坏蛋白质的空间结构。 巯基乙醇：还原剂，破坏二硫键 SDS和巯基乙醇同时作用：能将蛋白质解聚成多肽链
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SDS + 蛋白质
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
第八章 电泳分离技术
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一、电泳概念
电泳：是指在电场作用下，带电颗粒向带相 反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
（一）、被分离物质的本性（内部因素） 1、结构（形状） 2、电荷 3、大小
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（二）、外部因素
1、支持介质 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
ppt课件பைடு நூலகம்
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（1）、介质可能对样品物质有吸附作用
（2）、电渗作用 电渗就是在电泳过程中，由于支持物吸
附水合离子（H3O+）或OH-，使溶液相对带正 电或负电，在电场作用下溶液向相反的方向 移动，这一现象称电渗。
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（三）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
加样
样品 迁移 方向
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1、不连续PAGE电泳：用浓缩胶（上层胶）和分 离胶（下层胶）两种不同浓度，不同pH的凝胶灌制 凝胶板，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应， 达到蛋白质高分辨率的分离。
分离胶 12%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH8.8）
电渗方向与离子分离方向相同→加速 电渗方向与离子分离方向相反→减速
浓缩胶：大孔胶 分离胶：小孔胶
样品在大孔与小孔凝胶的界面 处浓缩，区带变窄。
浓缩胶 分离胶
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②缓冲离子成分的不连续性
上电极缓冲液：（Tris+ Gly- ）
浓缩胶： 分离胶：
（Tris+ Cl-）
下电极缓冲液pH：（Tris+ Gly- ）
Cl-：为快离子
Gly-（甘氨酸，pH6.8）pp：t课件为慢离子
浓缩胶 3.5%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH6.8）
电泳缓冲液（Tris-glycine（甘氨酸）， pH8.3）
浓缩胶与分离胶之间pH的不同，可以控制甘氨
酸的解离度，从而控制ppt其课件有效迁移率。
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浓缩胶pH=6.8：使慢离子较所有被分离样 品的有效迁移率低。 氯离子>蛋白质>甘氨酸
a：丙烯酰胺的质量（g） b：甲叉双丙烯酰胺的质量（g） m：缓冲液的终体积（mL） T：两个单体的总百分浓度 C：与总浓度有关的交联百分浓度
凝胶的机械强度和孔径大小等由T和C
两个参数决定。
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（二）、分类
根据凝胶孔径和缓冲体系的不同： v连续电泳 v不连续电泳
根据样品的处理方式不同： vSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 v常规（非变性）电泳
分离胶pH=8.8：使慢离子的有效迁移率比 所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离 子界面的影响。 氯离子>甘氨酸>蛋白质
甘氨酸的pI=5.97
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三种负离子（快离子、慢离子和蛋白 质）移动速度相同时，则快离子和慢离子 之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的 界面。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好 介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个 移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的 中间层。
1.4g 1g
引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电 荷的10倍，消除了蛋白质原有电荷的影响。
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②、SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象 的改变。
蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状为长 椭圆棒，短轴长度都一样，约为10Å，而长轴 则随蛋白质的分子量成正比地变化。
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影响PAGE电泳的内部因素： 电荷，形状和大小
影响SDS-PAGE电泳的内部因素： 大小
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2、应用：测定蛋白质亚基分子量
选用已知分 子量的标准 蛋白质，与 分子量未知 的待测蛋白 质样品在同 一条件下进 行SDSPA G E 电 泳 。
蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率和分子
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量的对数成线性关系。
三、影响电泳分离的因素
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②、分子筛效应（浓缩胶没有）
分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径 的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不 同的迁移率。
③、电荷效应 每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁
移率不同。
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小结
样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的， 电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中 进行的。
在蛋白质样品进入分离胶时，慢离子 跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使 蛋白质进入到均一电势梯度和pH的分离胶 中。
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（四）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
指整个电泳体系所用的缓冲液成分、pH、凝 胶孔径都相同，主要依据分子筛效应和电荷 效应分离蛋白质。
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（五）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
浓缩胶 3.5%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH6.8）
电泳缓冲液（Tris-glycine（甘氨酸）， pH8.3）
不同的pH，氯离子和甘p氨pt课酸件 将会在电泳中发挥作用9
2、样品分离原理 （1）样品的浓缩效应 （2）凝胶的分子筛效应 （3）电荷效应
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（1）样品的浓缩效应
电泳介质的四个不连续性，使样品在 电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离 。 ①、凝胶层的不连续性