叶绿体得提取一、试剂配置１、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。
05=９、7６g)、山梨糖醇(0。
33×182。
2＝60。
1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。
1×0、00２=0、３962g);2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。
３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。
05=11。
915ｇ);３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水;实际配制:PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ),悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml);8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。
(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl)二、提取步骤1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成;4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。
6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。
5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。
叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。
6、２000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做)8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用水平离心头得离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到１),下降也要缓慢下降,否则会破碎Perｃoｌ得浓度梯度层得形成,取出会瞧到３层绿色带,最上层为破碎得叶绿体,沉在地层得为粗颗粒,40－80％得Peｒcol 之间得界面有一层绿色层为完整得叶绿体;9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg.mｌ—1;(计算:取叶绿体悬浮液0.1mｌ,加4.9 ml８０%得丙酮,摇匀后于１0０0g离心2ｍin,上清液置于１ｃm得比色杯,在６25nｍ上比色,按照公式计算:OＤ6×５０/34.５＝叶绿素ｍg/mｌ)２5ｎm10、测定叶绿体得完整性,完整率达到８５-95%;参考:TakedａK,Otaubo T,Kｏnda N. Ｐarticipaｔion of hydｒogen ｐeroｘｉde iｎthe inactiｖationｏf Cａｌｖin—cycle SH ｅnzyme inｓo2—furmugaｔｅd ｓｐｉnacｈleaves。
Plant and cell Phｙsioｌogy,１982,２3:1009—1018。
取上述制备得完整叶绿体进行如下测定:1、用５0mM PBS(保护酶或其她测定项目得缓冲液)稀释2－5倍,用于测定SOD、POＤ、CAT、ＡPX;2、用冷丙酮稀释2倍,取0。
5MＬ提取液用于测定H２Ｏ2;(本试验中用０。
2mｏl/L ＨClＯ４稀释)3、用5％得TCA稀释2-5倍,取1。
5ml用于测定MDA;4、用乙醇:丙酮:水=4。
5:4。
5:1稀释,用于测定叶绿素;抗氧化酶(SＯＤ、ＰＯD、CＡT、APX)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(ＳOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂得配制(1)0.０5mｏl/Ｌ磷酸缓冲液(ＰBS,pＨ7。
8):A母液:0。
2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12Ｈ2O(分子量358.14)71．7g;Ｂ母液:0.2ｍol／Ｌ磷酸二氢钠溶液:取NaＨ2PO4·２H2O(分子量156.01)31.２g。
分别用蒸馏水定容到10０0ml。
0、05moｌ/L ＰBS(pH7、8)得配制:分别取A母液(Nａ２HＰO４) 228。
75mｌ,B母液(ＮaＨ2PO4) 2１.25ml,用蒸馏水定容至１0０0ｍl、参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术。
高等教育出版社,2０00:26７～26８。
(2)14。
5mM甲硫氨酸溶液:取2、１637g Meｔ用磷酸缓冲液(pＨ7。
８)定容至１0０0ml。
(３)3０μM EDＴA－Ｎa2溶液:取０。
001gＥDTＡ-Na２用磷酸缓冲液定容至100ml、(4)60μＭ核黄素溶液:取０、0０２3ｇ核黄素用磷酸缓冲液定容至100ｍl,避光保存。
(5)２。
25ｍM 氮蓝四唑(ＮBT)溶液:取0。
1840g NBT用ＰＢS定容至100ml,避光保存。
(上述试剂先配好,放到４度冰箱,用之前临时按下面得方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上层,避免见光,第一组样品加好后拿出来加,加完后放回冰箱,第二组得样品加好后再拿出来加)酶液制备:取0。
２g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷得研钵中,加入1。
6mｌ50ｍmｏｌ/Ｌ预冷得磷酸缓冲液(pH7、8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、1２000g下离心20min,上清液即为酶液。
2、酶活性测定(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Mｅt溶液１６2ml,ＥDＴA－Ｎａ2溶液0.６mｌ(加得量与前面得浓度要核对),磷酸缓冲液5、4ml,NBT溶液６mｌ,核黄素溶液6ｍl,混合后摇匀;SＯD反应混合液:3个处理*２个品种＊3次重复*3mｌ＊３次测定=162ml(实际配置２0０ml)(2)分别取3ｍｌ反应混合液与30μl(可视情况调整,最好先做一个浓度梯度,瞧加多少合适,如果量太少,最好稀释后再加,这样精确)酶液于试管中(尽可能加到试管得底部,要靠着试管壁打下去先加酶液,后加反应液,加好后摇一摇,瞧瞧试管上就是不就是有雾气,最好拿纱布把试管下边擦一下,免得雾气挡住光线照过去);(3)将试管置于光照培养箱中在4０0０lux光照下反应2０min;(照光很重要,试管要选择相同规格得,因为不同得试管透光率就是不一样得,试管架不要选择遮光得,这个最好分组做,同时几组做相互之间会遮光,每一组一个重复,就就是每一组中都要有所有得处理,且都要有一个最大管,处理多得话,把根与叶分开做,最大管放在中间)同时做两支对照管,其中１支试管取3mｌ反应混合液加入３0μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
(4)以不照光得对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测OＤ5６０(出现颜色即可测定)。
(5)酶活性计算:ＳOD活性单位以抑制NＢＴ光化还原50％所需酶量(测得样品值要在最大管得一半左右才合适,否则要调整酶量)为1个酶活单位(u)。
SOＤ总活性＝［( A ck－A E )×V］／(１/２Aｃk×W×Vt)ＳＯＤ比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOＤ总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g ＦW);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;A ck为照光对照管得吸光度;ＡE为样品管得吸光度;Ｖ为样品液总体积(ml,1、6ml,加入PBS得体积);Vt为测定时得酶液用量(ml,30ul);W为样品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体得质量mg);蛋白质含量单位为mg／ｇ。
二、PＯＤ、CAT酶活性得测定粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶(ＰOD)活性测定(愈创木酚法)(1)试剂配制:0、２moｌ/L磷酸缓冲液(pH6、0):分别取A母液(Na２HＰＯ4 ) 12３ｍl与B母液(NaH2PＯ4)877m ｌ混匀即为1000ml ＰBS(0。
２Ｍ,pH6、0);(２)反应混合液配制(以60个样为准):取2０0ｍl PBS(0。
2M,pH６、0),加入0.076ml液体(原液)愈创木酚(２－甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0。
1１2ml30％得H２O2,混匀后保存于冰箱中备用。
PＯD反应混合液:3个处理＊2个品种＊3次重复＊3ｍｌ＊3次测定=1６2ml(实际配置200ｍl, 0.076ml, 0、112ml)(3)样品测定:取3ml反应液并加入30μｌ酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值(测定４0秒)。
(边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢得话,要保证每个样品从加好样到开始记时得时间相差不大)(4)酶活性计算:以每ｍｉn OＤ值变化(升高)0、０1为1个酶活性单位(u)、POＤ=(ΔA４70×Vt)/(Ｗ×Vs×0、01×t)(u/g miｎ)ΔA4７0:为反应时间内吸光度得变化;Ｗ为样品鲜重(ｇ);ｔ为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,(1.６ml);Ｖs为测定时取用酶液体积(ml,30ul)。
2、过氧化氢酶(CAT)活性测定(1)试剂配制:0、１5mｏｌ／L磷酸缓冲液(pH7。
０):取A母液(Nａ2HPO4) 457、5 ml 与B母液(NaH2PO４) 29２。
５ｍl混合后用蒸馏水定容至1000ml、(２)反应液配制:取20０ml ＰＢS(０、1５M,pＨ7.0),加入0、３092ｍl 30%得H2O２(原液)摇匀即可。
ＣAT反应液:3个处理*２个品种＊3次重复*3ｍｌ*3次测定=162ｍｌ(实际配置200 ml, 0、３０92ml)(３)样品测定:取3ml反应液加入0.1ｍｌ(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,测定OＤ２40(紫外)(测定40s)。
(４)酶活性计算:以每min ＯＤ值减少0。
０1为1个酶活性单位(u)、ＣＡT=［ΔA240×Ｖt]/(W×Vｓ×0。