§2. SDS-凝胶电泳检测木瓜 凝乳蛋白酶的纯度
❖一、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺和交联剂甲叉 丙烯酰胺在催化剂作用下，聚合而成的凝胶， 凝胶具有网状立体结构和具有分子筛效应， 因此可用此凝胶为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有2种形式：
第一种，非变性聚丙烯酰胺凝胶：蛋白质在电 泳中保持完整的状态，在电泳过程中影响蛋 白迁移速率的因子包括：蛋白大小、蛋白形 状和蛋白所带电荷。
二、试剂与材料 1、10%过硫酸铵溶液 （新鲜配制） 2、 TEMED（四甲基乙二胺）（避光保存） 3、分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl,pH8.8 4、浓缩胶缓冲液：0.5M Tris-HCl, pH6.8 5、染色液：0.05%考马斯亮蓝甲醇溶液 6、脱色液：7%冰醋酸 7、蛋白标准、木瓜凝乳蛋白酶样品 8、材料：电泳仪电源、 垂直电泳槽
实验目的 ❖ 1、掌握考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量的原理
和方法 ❖ 2、掌握SDS-凝胶电泳检测酶蛋白纯度的原
理和方法
§1 木瓜凝乳蛋白酶含量测定
一、实验原理 考马斯亮蓝法：根据蛋白质与染料特异性结 合原理设计的。考马斯亮蓝G-250 （Coomassie brilliant blue G-250）在游离 状态下呈红色，最大光吸收在488nm处；当 它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为蓝色， 这个结合主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结 合。
❖ 第二种，变性聚丙烯酰胺凝胶：在非变性 凝胶电泳中加入SDS和巯基乙醇变性剂， SDS能破坏蛋白质分子之间的非共价键， 在巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下，蛋白 质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。
❖ 蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物，该复合物具有3个特点:
❖ A.所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷 量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差 异；
❖ B.在溶液中的形状像一个长椭圆棒，消除了蛋白质 间分子形状的差异。
❖ C.不同蛋白质所形成的椭圆棒的短轴是相同的（约 18μm），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小 成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电 泳迁移率主要取决于蛋白质分子量的大小。
❖ 当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDSPAGE可以分离、鉴定蛋白质，也可检测其纯度。
其结合物在595nm左右波长下有最大光吸收, 而且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此 可用于蛋白质的定量测定。该结合反应在 2min左右的时间内达到平衡，且在室温下 1h内保持稳定。
该法具有操作简便、反应灵敏、稳定性强的 优点。
适用测定蛋白质浓度的范围为0～1 000μg／ mL。
❖ 二、实验材料 ❖ 1.考马斯亮蓝G-250 ❖ 2.标准蛋白液：0.5mg/mL牛血清白蛋白 ❖ 3.NaCl溶液 ❖ 4.木瓜凝乳蛋白酶纯化酶 ❖ 5.分光光度计
（µg/mL）0
上述溶液摇匀，室温反应2分钟，在595nm处测定吸光度， 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线； 并同时测定木瓜凝乳蛋白酶的吸光度，在标准曲线上求出 木瓜凝乳蛋白酶的含量。
v 四、实验结果
v 1、做出标准曲线并求出其相关系数
v 2、求出木瓜凝乳蛋白酶含量 （µg/mL ）
要求 1、蛋白含量测定：2人/组 2、SDS-凝胶电泳：每人做一块胶，2人/套电泳槽 3、实验完毕，所有器皿必须清洗后收到实验柜中
值日：第1-3组
四配、制电实泳验凝方胶（法包括分离胶和浓缩胶）
上样（上样量为10 µl ,注意不留空槽） 电泳（浓缩胶150V电压，分离胶180V） 电泳胶处理（染色、脱色、拍照保存）
分光光度计PC3100使用注意事项： 测蛋白含量用“含量测定”模式
注意事项： 1、制胶时操作戴PE手套 2、玻璃板必须擦干净再做胶
三、实验方法
试管
CK 1
2
3
4
5
6 样品 样品 ……
BSA（µl）
50 100 200 300 400 500
0.5mMNaCl(µl)
450 400 300 200 100 0
0.15 mMNaCl(µl) 500
样品（µl）
500 500
考马斯亮蓝（mL） 5
5
5
5
SA 稀释后浓度