克氏双糖铁琼脂（KIA）
• 葡萄糖∶乳糖＝1∶10 • 铁：枸橼酸铁铵 • 指示剂：酚红 – 我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。
葡（－） 乳（－）
葡（＋） 乳（＋）
克氏双糖铁琼脂（KIA）
葡（＋） 葡（＋） 乳（－）H2S（＋） 乳（－）
原理
以葡萄糖＋，乳糖－为例 葡萄糖是最早利用的单糖，发酵葡萄糖的中间产 物丙酮酸为酸性，酚红指示剂为黄色。
• 结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。
氧化酶试验
• 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的 最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化， 再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化 合物。
• 试剂：1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺。
• 方法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。 • 结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。
O-F试验
• • • • • • • • 将实验菌种接种到2支O-F管中 在其中1支管中加入无菌液体石蜡，厚度0.5cm左右。 35℃培养18-24小时。 结果 开口管 黄色 黄色 绿色 加石蜡管 黄色 绿色 蓝色 结果 发酵型（F） 氧化型（O） 产碱型
VP试验
产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲 醇，乙酰甲基甲醇被氧化（在碱性溶液中）生成二乙酰， 后者可与含胍基的化合物反应生成红色化合物，称VP试 验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，VP阴性。 VP甲液：5%α －萘酚
– 有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌； – 有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；
– 有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞
菌等。
• 硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝 酸。
• 试剂：甲液 乙液
对氨基苯磺酸 α -奈胺
• 结果：出现红色为阳性。 • 若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原， 试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假 阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则 表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴 性。
• 有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等， 生成硫化氢 H2S＋Fe 黑色的硫化亚铁
• 问：有无葡萄糖－，乳糖＋的情况？为什么？
MIU试验
• 半固体 • M代表动力 • I代表吲哚（靛基质） • U代表尿素 • 结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二
管变红为尿素阳性），然后加入对二甲基氨基苯甲醛，观
察吲哚试验结果。
• 思考题：
KIA的试验原理
实验内容
• 1、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征
• 2、将四种试验细菌接种各种生化反应管：O-F管2支，KIA、 MIU、硝酸盐还原各1支，葡萄糖磷酸盐蛋白胨水2支。接种 完毕放置35℃培养18-24小时。 • 3、过氧化氢酶试验、氧化酶试验
• 注：以组为单位做四株试验菌，每位同学做一株菌。
• 若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管， 如有气泡产生，表示有氮气生成。
过氧化氢酶试验(触酶试验)
• 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和 新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。 • 试剂：3％过氧化氢溶液。 • 方法：取待测菌涂在玻片上，然后加3％过氧化氢数滴立 即观察结果。
硝酸盐还原试验
• 原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中， 硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞 内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚
硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸
盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还 原性产物。
• 硝酸盐还原的过程因细菌不同而异:
胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚 铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细 菌。
尿素分解试验
变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基
呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色。
阳性 阴性 尿素酶试验
吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用 （C）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为 IMViC试验。大肠埃希菌呈“++--”，产气肠杆菌为 “--++”。
VP乙液：40%KOH
甲基红试验
产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液
pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，
大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性pH＜
5.4，指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。
枸橼酸盐利用试验
能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌， 分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，
斜面
1、斜面生长的菌量多，面积大，跟氧分子接触的面积也
大 氧化 丙酮酸 CO2＋H2O 中性，PH不变 2、斜面蛋白质被细菌利用，氨基酸被利用产生NH3，碱性，
酚红指示剂为红色。
高层
• 高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在24小时内
不会被氧化，因此仍为黄色。
结果
• 高层－黄色
斜面－红色
• 如葡萄糖＋，乳糖＋，则高层与斜面均为黄色（24小时 内）。 • 如果延长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同 时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变 为红色。
糖发酵试验
细菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，可借以鉴 别细菌。一般非致病菌能发酵多种单糖，如大肠埃希菌能 分解葡萄糖和乳糖，产生甲酸等产物，并有甲酸脱氢酶， 可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气， 以“⊕”表示。伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸，但无甲酸脱 氢酶，故生化结果为产酸不产气，以“+”表示。伤寒沙 门菌不能分解乳糖，以“-”表示。
由此使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）
由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。
吲哚试验（靛基质）
含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）
可分解色氨酸生成吲哚（靛基质），若加入对二甲基氨基
苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验
阳性。
硫化氢试验
变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如
实验四
常用的生化反应
实验目的
• 认识染色方法鉴别细菌的局限性 • 掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断
实验菌种
• 产气肠杆菌（Enterobacter • 普通变形杆菌（Proteus vulgaris） • 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）