5‘
随机引物
标记的DNA片段
REMOVE
REMOVE bait DNA
Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD
lacZ
bait DNA
Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD
磷酸化酶,激酶(kinase)
逆转录酶(reverse transcriptase) RNase H, RNase A 甲基化酶(methylase)
载体及其构成基本要素



能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝 粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记
常用宿主
大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存
酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因
表达
lacZ
如何提高克隆效率?
提高插入片段和载体的比例
尽可能采用粘端连接*
载体脱磷以降低载体自连
插入片段磷酸化
改进转化条件
问题:
有一外源片段用某种酶切,生成了5´ 突出粘性 末端 5´ -GATC, 但是载体上的单酶切位点 只能生成下面这几种粘性末端: 5´-CTAG 5´-TCGA 5´-TTAA 应当采用怎样的策略来提高连接效率?
酸基团
反应条件：Mg++，ATP存在
其它工具酶
聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端转移酶 外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I 脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP
第十四章 遗传工程
利用转基因手段对生物进行 人为改造的技术
什么是遗传工程？
体外DNA重组技术：利用工具酶将
外源片段和载体连接，导入生物体工作 生物产品(生物反应器) 改良物种(提高品质)

基因治疗
工具酶
A. 剪切酶类
有目的有选择的把目的片段切开
B. 连接酶类
不依赖于内切酶和连接酶的体外重组
----位点专一性重组
（依赖于短片段同源序列的重组）
cosN, LoxP
cre
LoxP
LoxP
LoxP
LoxP
Transform
+report gene substrates
新鲜组织研磨或匀浆
rRNA tRNA mRNA AAAAAAAA
RNA提取液
总RNA
过oligo(dU)柱
TTTTTTTTT AAAAAAAA
洗脱
AAAAA同位素标记：32P
非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等
模板DNA 变性
随机6核苷酸引物， dNTP, 某种标记dNTP DNA Pol I
Sma I
5´ ... C C C^G G G ... 3´ 3´ ... G G G^C C C ... 5´
Xma I
5´ ... C ^ C CG G G ... 3´ 3´ ... G G GC C ^ C ... 5´
同粘酶
BamH I
5´ ... G^G A T C C ... 3´
3´ ... C C T A G^G ... 5´
Bgl II
5´ ... A^G A T C T ... 3´ 3´ ... T C T A G^A ... 5´
Sau3A
5´ ... ^G A T C ... 3´
3´ ... C T A G^ ... 5´
连接酶及其对底物的要求:
T4 Ligase, Ecoli Ligase
底物:
自由5’末端和自由3’末端, 5’末端带磷
转基因动物：医学研究，生物制药 转基因植物：改良品质，提高抗逆能力 基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病
5´ C A U G 3´ 3´ G U A C 5´
mRNA Antisense RNA
将目的片段和载体相连
C. 其他工具酶
修饰, 加工等作用
限制性内切酶II及其产生的3种不同末端
5'突出的粘性末端
P
EcoR I
P
3'突出的粘性末端
P
Pst I 平末端
P P
EcoR V
P
同切酶和同粘酶
同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端
同切酶
lacZ
Bait DNA
Bait DNA
PCR技术及其应用
应用范围：


检测和诊断（高灵敏度）
基因克隆（eg: 通过部分已知序列扩增未知目标片段
其他常用分子生物学技术
丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 脉冲电泳 双向电泳 Southern杂交 northern杂交 western杂交
转基因动植物和基因治疗


易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主
常用载体
质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬
粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC
特殊用途的载体
表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体
宿主
•繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 •对所携带基因的表达产物具有较高耐受性, 具有 克隆最多种基因的可能 •突变率低, 能够稳定忠实的保存被克隆基因