注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静，注意样品不能混样。
2、实验步骤
⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀， 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
⑵ 将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地 倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整 个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至 凝胶完全凝固。 ⑶ 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。将凝胶置 入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆 盖凝胶1-2mm。
⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品xμ l于一次性 手套上，再加入一定量的6X/10X loading buffer，混匀后，小心加入点样孔。每加完一 个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样 时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样 前要先记下加样的顺序）。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到 溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min60min：当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
枪头
装枪头 带手套 灭菌 外包报纸 灭菌后50-70度烘干后使用 带手套
0.1to 10 ul clear Tips
0.5 to 10 ul Clear Tips
1-200 ul clear Tips
1-200 ul Yellow Tips (Universal Fit)
1-200 ul Clear, graduated (Universal Fit),
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围用. 常用的6X载样缓冲液
Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液
Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
二、凝胶成像
1、具体步骤



1 打开凝胶成像仪电源（机器后部），开电脑； 2 将染色后凝胶用水冲洗后，将凝胶放在透射板正中， 并关严暗仓门，打开紫外灯； 3 打开Quantity one软件，点击basic，File中选择 Get Doc EQ…，调节使图象到达合适亮度、大小及清晰度； 4 待图象最优化时，成像freeze在屏幕上，关闭紫外灯， 点击“Save”保存； 5 关闭软件； 6 打开暗仓门，拉出透射台，凝胶丢弃至专门垃圾桶， 插掉透射板上水迹； 7 关上暗仓门。



DNA的提取过程就是用化学和物理的方法， 使DNA与其他细胞物质分离开来的过程。 一般本实验室采用的有高盐法，CTAB法， 煮沸法。 本次实验采用SDS高盐沉淀法。
菌株划LB平板活化，挑单菌落，接3ml 试管，于30℃剧烈振荡培养过夜至稳定 期。离心收集菌体1ml，然后用等体积 TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 等体积TEN中。 加入200ul溶菌酶（100mg/ml），37℃水 浴1h，再加入300ul 20%的SDS，37℃水 浴至溶液澄清。** 加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡，12000 rpm离心10min。我们的实验中上清就取 1ml,以方便后续实验。
多通道枪
混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数
分子操作在加样后、反应前都要充分混匀
一、枪混匀 二、旋涡混匀器
三、手动混匀: 颠倒混匀: 0.5-1.5ml管 30%-70%体积时,试管 30%-70%体积; 擦边混匀: 0.2-0.5ml管 30%体积以下 0.2ml管,0.5ml管15% 体积以下
酶切后质粒 原质粒
ocDNA 线状DNA cccDNA
3、琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 （2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测 仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。
配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。一般琼脂糖凝胶电泳 适用于大小在0.1kb～60kb范围内的DNA片段
分子生物学基本操作
手套
原则上不论什么实验都应带手套操作 特别是 无菌操作； 与RNA有关的所有操作； 重要克隆菌的挑单克隆，扩增，保存等

与有毒试剂有关的所有操作，比如染胶时 的EB；提取用的有机试剂（通风橱）；
Pipett
量程:使用合适量程的枪(移液器) 校对:定期 使用: 一定在合适量程范围内使用; 枪头必须插紧, 防止脱落以及吸 样体积不够; 用第一档吸样,打出样品到第二档; 吸样时防止倒吸; 不要水平放置带有枪头的枪; 使用后挂在枪架上,不可以乱放
1-200 ul Clear, Non-Beveled
1-200 ul Yellow, Non-Beveled
1-200 ul Clear, Extra-Long
100-1300 ul Blue Graduated Tips
100-1000 ul Tips, fit Gilson LTS Pipetor
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效 应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因 而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以 通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而 得到检测。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的 DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不 同的DNA分子。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其 荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样 品DNA浓度。



细菌DNA的提取
环状双链DNA、不与组蛋白结合（古菌具 有组蛋白类蛋白）、基因总数水平一般为 103-104，一般情况下，一个细胞中只有一 条染色体或一套基因组。
The E. coli genome is a circular double-stranded molecule of DNA; this DNA molecule is 4,639,675 base pairs in length and encodes 4267 genes.
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头



比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips 它 不会有残留； 如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）； 与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头； 加样体积应为枪头最大体积的20%-100%，低于该 范围的用小一号的枪头；大于该范围的可以用同 样的枪头加样两次（两次体积相当，比如加210ml, 可以用200ml枪头以105ml加两次）；
0.5-1.5ml管 15%40%体积时;试管30% 体积以下，
水浴

提前10-30分钟调好温度;稳定 后才能使用;
水位不可以低于水浴锅高度 的50% 用合适浮子; 定时; 使用后需要添水或换水 关闭电源


离心

离心前，如果需要预冷，至少预冷15分 钟。盖好管盖，充分混匀； 质量对称放置； 不合适的离心管应外套其他型号的管子； 如离心0.2管，最好是放在0.5管套1.5管中； 如短暂离心可以放在1.5管中； 盖上离心机的内盖 离心后，如果要移动，放在试管架上移 动，防止破坏液面； 短暂离心要在3000-8000rpm范围内；时 间应短于30秒； 如果离心机被有机试剂或其它样品污染 当事人应及时清理
2、Quantity One 软件


是The Discovery Series 软件家族的成员，它是一 个功能强大的灵活软件包，可成像和分析一维电 泳凝胶、斑点印迹、狭线 印迹和菌落计数。 Quantity One 软件能定量和分析多种数据，包括从 光密 度仪、储能磷屏成像仪、荧光成像仪和凝胶 成像系统采集的放射性、化学 发光、荧光和染色 等样品。Quantity One提供自动分析功能以快速获 取高 质量结果。
3、注意事项
1 开关仓门时防止将EB沾在仓门盖上; 2 透射板紫外灯寿命有限，调整图象后及时 成像； 3 凝胶应及时清理，防止凝胶固化后贴附在 透射板上，造成成像不清晰； 4 成像结束后插掉透射板上水迹，防止仪器 内部生锈引起短路。






上清用等体积酚抽提1次， 12000 rpm离心 10min，小心地吸取上清。 上清再用等体积的酚：氯仿抽提1次， 12000 rpm离心10min，收集上清。 上清再用等体积的氯仿抽提1次，收集上清。 上清中加入等体积TE（稀释调整NaCl浓 度），0.6倍体积异丙醇沉淀，12000 rpm离 心10min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后 溶于100ul TER中，取1ul电泳检测，其余的20℃保存备用。
加样


加用任何试剂前要将试剂混合（除饱和酚， 或一些特别的有机试剂） 加样的枪头应在试剂的中间表层吸收，防 止枪头外壁带用过多试剂，改变加样实际 体积（除饱和酚外，一定要伸到tris饱和液 下的酚中） 加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及 外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从 反应体系的管底吸上，反复吹打
植物总（核）DNA样品
应呈现一条迁移率很小
的整齐条带。
质粒DNA的存在形式有3种： ① 共价闭环DNA（cccDNA）， 常以超螺旋形式存在； ② 开环DNA（ocDNA），此种 质粒DNA的两条链中有一条 发生一处或多处断裂，因此 可以自由旋转从而消除张力， 形成松弛的环状分子； ③ 线状DNA，因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成。 因此质粒DNA电泳的结果中 有可能出现三条泳带，它们 的泳动速度为：cccDNA > 线 状DNA > ocDNA。