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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞种类
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的样本来源
• 外周血 • 脾脏 • 淋巴结 • 胸腺 • 骨髓
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的目的
• 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体 免疫状态
• 免疫细胞的细胞生物学研究 • 免疫细胞的培养和建株
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（一）中性粒细胞功能检测
• 细胞趋化功能的检测 • 吞噬功能的检测 • 杀菌功能的检测
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
趋化功能检测——检测细胞运动功能
• 体内试验法：皮肤窗法 • 体外试验法：滤膜渗透法
琼脂糖平板法
皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮 皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12， 24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集 开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
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免疫细胞的分离和功能检测
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
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外周血中性粒细胞分离(Ficoll-Hypaque)
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二、相关功能检测
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀 灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术
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腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞
腹腔注射诱导剂 3－4 days
腹腔内注射肝素PBS
处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）
洗涤细胞、计数
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（三）中性粒细胞的分离
• 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
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NBT还原试验
方法： 1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育 25min。 2.推片染色、镜检。 正常值：
NBT阳性细胞率应≥95%
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（二）巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾 巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉 注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间 反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流 中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
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分离免疫细胞的一般原理
• 物理学和生物学特征 • 密度大小 • 表面标志 • 其它活性：吞噬、黏附等
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目录
1 吞噬细胞的分离和收集 2 外周血单个核细胞的分离和纯化 3 淋巴细胞及其亚群的分离
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趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显 微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和 向右孔的移动距离B，计算趋化指数。
趋化指数= A/B 趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强
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（一）中性粒细胞吞噬功能检测
• 显微镜检查法
吞噬率(%)
吞噬细菌的白细胞数 计数的白细胞数
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第一节 吞噬细胞的分离和收集
吞噬细胞的种类 ﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统 ﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞
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一、吞噬细胞的分离
（一）单核细胞的分离
特征性标志 CD14 分离技术 • Pecoll密度梯度分离法：获取细胞数较少 • 流式细胞仪分离技术 设备要求高，操作复杂 • 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 • 黏附法:影响细胞功能
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免疫磁珠分离法
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（二）巨噬细胞的分离 ☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
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斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞
20世纪70年代由我国免疫学家创立 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞 分离方法
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吞噬指数菌功能检测
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
甲chan（紫黑色）
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硝基四唑氮蓝试验 （NBT试验）
本法用于检测中性粒细胞胞内杀菌能力，由于中性粒细 胞在杀菌过程中能量消耗剧增，耗氧量亦随之相应增加， 磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氢化脱氢，此 时加入NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成 点状或块状甲簪颗粒并沉积在胞浆内.
开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。
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滤膜渗透法
原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加
入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分 隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下 室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取 滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜 下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋 化功能。
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中性粒细胞趋化功能检测
－－Boden 小室法
Boyden Chamber Shi et al. J Immunol Methods, 1993, 164: 149
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琼脂糖平板法
原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加