凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点



一、原理:
IEF 1966年由瑞典科学家发明。
蛋白质分子由不同数量和比例的各种氨基酸组成，氨基酸侧 链在不同的pH值环境中所带的电荷不同，当蛋白质处于等电点时， 它的净电荷为零，因此可利用等电点差异分离。 凝胶等电聚焦法的关键是，它是一种多羧基多氨基的脂 肪族化合物，分子量在300-1000之间。国产和进口的两性电解质 载体均有各种规格。可以根据需要选择使用。良好的两性电解质 混合物，它的各种成分在等电点时有相当的缓冲能力。

二、具体实施方法
在凝胶中加入一种名为两性电解质载体(ampholyte ）的混合 物，在外加电场作用下，凝胶内就会形成一个从正极向负极依次 增加的pH梯度。在pH梯度环境中，加入含有不同等电点的蛋白质 混合样品进行电泳，无论它们的原始分布如何，（或在正极端； 或在负极端；或分布在整个凝胶中)，经过一定时间后，样品中各 组分都将分别聚焦在pH等于各自等电点的区域，形成分散的蛋白 质区带，使样品各组分得到分离。分别测定样品各组分聚焦部位 凝胶的pH值，就可以得到它们各自的等电点。由此可知，运用凝 胶等电聚焦法，不仅可以测定蛋白质的等电点，而且还可以将不 同等电点的蛋白质分离。

SDS-PAGE和IEF的异同


相同： 1、都是蛋白质电泳 2、都用聚丙烯酰胺做载体 不同： 1、分离原理不同，IEF按pI, SDS-PAGE按分子量 分离。 2、载体形状不同， IEF-柱状， SDS-PAGE-平板。 3、IEF中聚丙烯酰胺为抗对流介质，SDS-PAGE中 聚丙烯酰胺为分子筛。

蛋白质的分离模式图 箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度， 右图为平衡时蛋白质的分离状态。
三、实验方法及流程
电聚焦流程： 制备载体（加样）→电泳4h→剥胶 →固定（本次省略）→测定距离 ∟ →制作pH梯度→测定（电脑作图） 实验方法： 预先准备洁净玻璃管（0.5ⅹ9cm）两根，下端封闭垂直插在管架上。 按下列配方在小烧杯内配制凝胶溶液（5mL） 1、凝胶贮备液 2.5mL 2、两性电解质载体 0.25mL（老师处） 3、2%TEMED 0.25mL 4、蛋白质样品 （经计算有1mg左右） 5、蒸馏水(超纯水） （适量） 6、10%过硫酸铵 0.05mL（最后加） 轻轻混匀，立即用滴管装管至离上端0.5cm处，再缓慢加蒸馏水 3-5mm高，静止聚合30分钟。待凝胶与水之间有明显界面时，即聚合 完毕。