分类号：O657.7+2学校代码：10392学号：3100709140福建医科大学本科生毕业论文染发剂中苯胺类染料的HPLC检测方法Determination of Aminobenzenes in Hair Dyes by HPLC所在院系：药学院学生：伊满飞指导老师：欧阳立群起止日期：2014年01月至2014年05月二〇一四年五月目录中文摘要 (1)英文摘要 (1)关键词 (1)前言 (1)1.1 仪器与试剂1.11 仪器 (2)1.12 试剂 (3)1.2 实验方法1.2.1 标准溶液配制 (3)1.2.2 流动相的配制 (4)1.2.3样品预处理 (4)1.2.4色谱参考条件 (4)2 结果与讨论2.1 色谱条件优化 (5)2.1.1色谱柱的选择 (5)2.1.2 流动相选择 (5)2.1.3 流动相梯度选择 (5)2.1.4 检测波长选择 (6)2.2 样品提取实验 (7)2.2.1提取溶剂选择 (7)3 方法学实验3.1 线性及线性范围 (8)3.1.1标准曲线绘制 (8)2.2.2提取方法选择 (9)3.1.2线性范围 (9)3.2 方法检出限 (9)3.3 方法回收率和精密度 (10)4 结论 (11)参考文献 (12)附录属性信息 (14)染发剂中苯胺类染料的HPLC检测方法中文摘要本文目的是建立一种以苯胺类成分检测为主的研究方法，使其能对《化妆品卫生规范》中的染发剂苯胺类成分的液相色谱检测方法做一个补充，使其覆盖率高且灵敏，快捷而准确。
流动相选择，结果表明在本实验中采用乙腈+0.02 mol/L乙酸铵溶液作为流动相时，使用XB-C18色谱柱时可以较好分离这几种目标分析物，且色谱峰形良好。
提取溶剂选择，结果表明50%甲醇提取效率最佳。
方法回收率和精密度，8种染料加标样品的回收率在84.6%～104.2%之间，平行6次测定结果RSD值在2.1%～4.1%之间，结果令人满意，这些结果表明该方法具有良好的精密度和准确度。
关键词：苯胺类化合物，染发剂，HPLCAbstractThe purpose of this paper is to find a method for determination of aminobenzenes in hair dyes by HPLC, and to modified the more accurate and reliable method in Hygienic Standard for Cosmetics.Mobile phase selection, the result shows that choicing acetonitrile +0.02mol/L ammonium acetate solution as the mobile phase in this experiment, and using XB-C18 column can well separate the target analytes , keeps the peak shape perfect. Selection of extraction solvent, the result shows that 50% methanol is the most efficient. The recovery rate and precision, the recovery rate of 8 kinds of dyes sample is between 84.6% ~ 104.2%, and the number of RSD of 6 average determinations is between 2.1% ~ 4.1%。
The result is satisfactory, and these results show that the methods are full of good precision and accuracy.Key word: Aminobenzenes Compounds , Hair dye , High Performance Liquid前言早在4000年前人类就开始染发，古埃及的法老墓出土的一些文献上记载着，法老拉美西斯一世派人去美洲寻找草药，结果带来许多能用于染色的植物，除了用于染发以外，还能用来染指甲。
2000多年前我国也开始出现染发，中国文献记载《汉书·王莽传》中写道“欲外视自安，乃染其须发”[1]。
到了现代，人类已经拥有了专业的染发剂生产厂家，染发技术也愈发专业。
目前人们使用的染发剂依据染发效果可分为3类：暂时性，半永久性和永久性[2]。
暂时性染发剂可以用香波洗发水一次用香波洗发水一次性性将其从头发上洗脱下来，而半永久性染发剂需要用香波6-12次才能将其洗脱[3]。
永久性染发剂又可以分为：植物永久性，金属永久性，氧化永久性；前两者的染料分别提取于植物和矿物质，植物性染发剂价格贵[4]，国内少用，而金属性染发剂对人体伤害极大[5]，现已几乎不用。
后者氧化永久性染发剂是目前市场上最流行的一类染发剂[6]，含有染料中间体和偶合剂，这些小分子进入头发纤维内反应生成染料大分子[7]，所以难以从头发纤维孔径中洗脱出来，而染料中间体多是苯胺类等芳香类成分[6]，特别是对苯二胺及其衍生物[8]等有毒物质，正常染发时就易通过发髓、皮肤或呼吸等多种方式吸收入血，一旦进入体内便很难排出，容易蓄积中毒，而且具有诱导基因突变致癌作用和极易引发皮肤过敏反应[9]。
基于以上的安全问题不容忽视，各国都纷纷出台相关法规限制其有害物质的含量，并推荐了对其有害物质的检测方法。
我国《化妆品卫生规范》（2007年版)[10]中规定了93种暂时允许用的染料成分，且对其最大允许使用浓度、其它限制和要求等做了严格的规定，并推荐了7种允许使用的染料和1种禁用成分的液相色谱检测方法，但推荐检测方法对规范的要求覆盖率非常低, 还不能满足目前的分析要求。
而欧盟化妆品法规(Regulation (EC) No 1223/2009)[11]中推荐采用的薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法进行检测,所用方法较滞后,对于复杂组分的分离测定效果不显著。
因此，为了提高检测方法的灵敏度和准确度，有必要研究简便，快捷，灵敏的检测分析方法。
目前文献报道的检测方法已经有：离子色谱法[12]，毛细管电泳法[13]，气相色谱法[14-16]，高效液相色谱法[17-22]，气相色谱-质谱法[23-25]，高效液相色谱-质谱法[26]等；由于苯胺类化合物极性强，不易挥发，不稳定等性质使得GC法难以测定，其它方法的前处理也复杂耗时，而HPLC法则显得很合适。
所以本文目的是建立一种以HPLC对苯胺类染料成分检测为主的研究方法，使其能对《化妆品卫生规范》中的染发剂苯胺类成分的液相色谱检测方法做一个补充，能为以后各相关部门的检测需要提供一个快速简单准确的检测平台。
1.1 仪器与试剂1.11仪器Waters2998高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（美国Water公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；涡旋混合器（江苏健康医药公司）；分析天平（赛多力科（北京）科学有限公司，感量为0.1 mg）；微孔滤膜：0.45 μm。
1.12试剂：除另有规定外，所用试剂均为色谱纯，水为超纯水。
乙酸铵(优级纯，上海生工生物工程有限公司)；乙腈和甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司）。
8种染料标准品：纯度均≥95.0%，2-羟乙基对苯二胺硫酸盐(CAS号：93841-25-9)；2-氯-p-苯二胺硫酸盐(CAS号：61702-44-1)；4-氨基-N,N-二甲基苯胺(CAS号：99-98-9)；4,4’-二氨基二苯胺硫酸盐(CAS 号：53760-27-3)；2,6-二羟乙氨基甲苯 (CAS号：149330-25-6)；2,6-二甲氧-3,5-吡啶二胺盐酸盐（CAS号：56216-28-5）；羟乙基-3,4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐(CAS号：94158-14-2)；羟乙基-2-硝基-p-甲苯胺(CAS号100418-33-5)。
1.2 实验方法1.2.1 标准溶液配制染发剂标准储备液：准确称取8种染料对照品，置于50 mL比色管中，用10%甲醇溶液配制标准储备液，浓度分别为1.0 mg/mL于4 ℃冰箱储存，使用时按需稀释。
染发剂混合标准系列溶液：分别移取上述8种染发剂标准储备液，用50%甲醇配制成浓度如表1所示的标准系列浓度。
表1 标准系列浓度系列标准浓度/μg/mL名称/CAS号1 2 3 4 5 661702-44-1 1.0 2.5 5.0 25.0 50.0 100.0 99-98-9 1.0 2.5 5.0 25.0 50.0 100.0 53760-27-3 5.0 10.0 20.0 60.0 80.0 100.0 149330-25-6 1.0 2.5 5.0 25.0 50.0 100.0 56216-28-5 5.0 10.0 20.0 60.0 80.0 100.094158-14-2 5.0 10.0 20.0 60.0 80.0 100.0 100418-33-5 1.0 2.5 5.0 25.0 50.0 100.01.2.2 流动相的配制流动相溶液（0.02 mol/L乙酸铵）：称取1.54 g乙酸铵，加水至1000 mL，溶解混匀，经0.45 μm滤膜过滤，作为流动相用。
1.2.3样品预处理准确称取试样1.0 g（精确至1mg）于50 mL比色管中，加入50%甲醇20 mL，旋涡混匀器上涡旋1 min，冰浴超声15 min，混匀，冷冻高速离心10000 r/min离心5 min，过0.45 μm滤膜，供仪器分析测试。
1.2.4色谱参考条件色谱柱：XB-C18柱，250 mm×4.6 mm（内径），5 μm；或相当者。
流动相：A相(乙腈)+B相(0.02mol/L乙酸铵)，梯度洗脱程序见表2。
流速：1.0 mL/min柱温：35 ℃进样量：10 μL检测器：二极管阵列检测器检测波长：如表3所示。
表2 梯度洗脱程序时间/min 流动相A（%）流动相B（%）0 5 955 5 955.1 10 9018 10 9023 40 6028 40 6028.1 10 9032 10 90表3 检测波长名称 /CAS号波长/nm93841-25-9 23561702-44-1 24599-98-9 24553760-27-3 235149330-25-6 23556216-28-5 23594158-14-2 245100418-33-5 2352 结果与讨论2.1 色谱条件优化2.1.1色谱柱的选择实验使用表2所示流动相时，比较了RP Amide C16 和XB-C18柱对8种染发剂的分离效果及峰形。