1 、选择冷冻保护剂，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和 甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。 2、制备待冷冻保藏菌种悬液，制成孢子及菌体细胞悬液； 0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。 3、玻璃安瓿用酒精喷灯封口。 4、以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温 度之上℃)或 气相(-156℃) 中保存。 6、复苏： 迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加 速解；
保藏期
3~6月 6~12月
评 价
简便 简便
石蜡油封藏法*
沙土保藏法
低温、缺氧
干燥、无营养
各大类**
产孢子微生物
1~2年
1~10年
简便
简便 有效
冷冻干燥法
干燥、无氧、低
温、有保护剂
各大类
5~15年
以上
简便
有效
几种菌种（附图）
4.1菌菌种保藏注意事项及专业机构
注意事项:
1）经长期保藏后菌种存活健在。 2）保证高产突变株不改变现型和基因型， 特别是不可改变初级代谢和次级产物 生产的高产能力。 3、保藏方法经济简便。
4、冷冻真空干燥保藏法
首先把加一定保护剂的菌悬液冷冻，然后在冷冻 状态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久 的休眠状态，从而达到长久保藏的状态。
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 菌种 培养 灭菌 制备菌悬液 洗净烘干 装标签
分装安培瓶
预冻 真空干燥 测定水分 熔封管口
加棉塞
检查真空度
包藏
5、液氮冷冻保藏技术
5）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCC）； 中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）∶真菌。 卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。 中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。 6）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）； 中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所， 成都：新抗生素菌种。 华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种 7）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）； 农业部兽医药品监察所，北京。
2.1菌种保藏的目的及意义
• 目的
把微生物菌种资源在一定条件下保存， 使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发 生变异，保持菌株原有培养特性和生理活性。
菌种是国家的一种重要资源，保持优良 菌种的优良性能，可保证高产稳产；在基础研究 中，菌种保藏可保证研究结果获得良好的重复性
• 意义
2.2法律规定
• 2006年3月中华人民共和国农业部发布的《食用 菌菌种管理办法》规定：“农业部主管全国菌种 工作。县级以上地方人民政府农业（食用菌，下 同）行政主管部门负责本行政区域内的菌种管理 工作。”“县级以上地方人民政府农业行政主管 部门应当加强食用菌种质资源保护和良种选育、 生产、更新、推广工作，鼓励选育、生产、经营 相结合。”
冻结保藏法 冷冻干燥保藏法
干燥保藏法 液氮保藏法
大多数细菌
3.4放线菌菌种的保藏
放线菌菌种的长期保藏以保藏放线菌的分生孢 子为主要方式。 保藏方法主要有： 沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体）
主要措施
低温 低温
适宜菌种
各大类 细菌、酵母菌
The end,thank you!
谢谢观赏
4.2 保藏机构
• 国际重要菌种保藏机构
缩写 ATCC 名称 美国标准菌种保藏所，马里兰州，罗克维尔 市
CBS
NCTC
真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
国立标准菌种保藏所，英国，伦敦
CCGMC 中科院微生物所普通微生物菌种保藏管理中 心 CCTCC 武汉大学中国典型培养物保藏中心
ARS
美国农业部农业研究服务部
菌种的保藏
生产中常用菌种的保藏
目录
什么是菌种？
菌种保藏意义、基本原理及策略
菌种保藏方法（常见菌种举例）
菌种保藏注意事项及专业机构
1.1菌种简介
• 用于发酵过程作为活 细胞催化剂的微生物， 包括细菌、放线菌、 酵母菌和霉菌四大类。 来源于自然界大量的 微生物，从中经分离 并筛选出有用菌种， 再加以改良，贮存待 用于生产。
优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。 缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种 容易变异。 适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌
斜面传代保藏法(附图)
2、矿油（液体石蜡）保藏法
1938年发明。 基本方法和原理：是在斜面培养或穿刺培养上
加一层液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥，
1.2菌种制备
也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经 过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生 产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一 步扩大菌体量及合成产物之用。
种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见上图） ，其中(1)～(4)为孢 子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取 少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天 (或较长时间)。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获 得更多孢子，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然 培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基 上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水 分降至10％以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生 产上延续使用半年左右。放线菌孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆 浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶 孢子培养基中,于28～37℃培养5～14天。所获得的大量孢子可直接作 为种子罐 (6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌 或产孢子不多的,则可采用摇瓶（5）液体培养制得菌丝体，作种子罐 的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、 繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如 葡萄糖）和氮源（如玉米浆等）,及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐 (7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。 接种量一般在10％～20％。
连续在培养基上（内）移种
菌 菌 种 种 保 保 藏 藏 方 方 法 法
生活态
传代培养保藏法
连续在活宿主上（内）移种
固体斜面 湿法 半固体琼脂柱 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 休眠态 藏在玻璃管内 干法 吸附在合适的载体上
3.2常见几种菌种保藏方法
• 1、斜面传代保藏法
把菌种接种到所需要的斜面培养基上，最适温度 下培养，长出丰满的菌体细胞或孢子后，置于4℃ 的冰箱或冷库中保藏。然后每隔一定时间重新移 接一次，传代保藏。移种时间因菌种不同而异， 几周到几个月不等。
3.1保藏方法
• 暂时保藏法
斜面传代法 穿刺法 液体石蜡法
注意：由于微生物的 多样性，不同的微生 物往往对不同的保藏
甘油管法
砂管保藏法
方法有不同的适应性，
因此，在具体选择保 藏方法时必须对被保 藏菌株的特性、保藏 物的使用特点及现有 条件等进行综合考虑。
• 长期保藏法
砂土管保藏法
滤纸片保藏法
冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
• 麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝 或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于 一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。 • 无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂 灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然 后将试管放于干燥器内，室温或4 ℃保藏。对于 细菌和真菌效果都较好。
3.3细菌的保藏
保藏方法 定期移植保藏法 液体石蜡保藏法 适合菌种 固氮菌属 芽孢杆菌属 棒状杆菌属 欧文氏菌属 黄杆菌属 微 球菌属 分枝杆菌属 假单孢杆菌属 根瘤菌属 埃希氏杆菌属 无色细菌属 气单孢菌属 芽孢杆菌属 纤维单孢菌属 色杆菌属 埃希氏杆菌属 克雷伯氏菌属 微球菌属 丙酸杆菌属 链球菌 属 变形杆菌属 根瘤菌属 弧菌属 醋酸杆菌属 无色细菌属 色杆菌属 纤维粘菌属 芽孢杆菌属 链球菌菌属 发光杆菌属 变形杆菌属 假单孢杆菌属 醋酸杆菌属 节杆菌属 短杆菌属 芽孢杆菌属 链球菌菌属 棒 状杆菌属 柄细菌属 乳杆菌属 分枝杆菌属 变形杆菌属 假 单孢杆菌属 欧文氏菌属 纤维单孢菌属 产芽孢细属
中国一般保藏机构
l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）； 中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。 中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AL－IV）：病毒。 2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）； 中国农业科学院土壤肥料研究所， 3）工业微生物菌种保臧管理中心（CICC）； 轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。 4）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCC）； 中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）∶真菌。 卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。 中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。
隔绝空气，降低菌种细胞代谢速率。此法适用 于各类微生物，尤其是不形成芽孢或孢子的真 菌，保藏期限2-10年。 操作方法：矿油灭菌； 菌种培养； 灌
注矿物油 ；低温（5 ℃左右）保藏
3、砂管保藏法
把微生物附着在沙质载体上，置干燥处进行保藏， 适合于保藏放线菌、芽孢细菌和某些真菌。保藏 时间可达几年到几十年。 制备砂管 ： 河砂60目过筛—去杂质漂洗—烘干 分装—灭菌—烘干。 准备菌种：在合适培养基上培养获得孢子。 接种：干法接种，直接将放线菌、真菌孢子接 种于沙管中。湿法接种，先将斜面培养物制成菌 悬液，吸取菌悬液于沙管中（每管约10滴）。 干燥保藏：将含菌沙管放在含干燥剂的干燥器 中吸水干燥。低温或室温下干燥处保藏。
• 其他保藏方法
• 冷冻法：分低温冷冻（－20 ℃）与超低温 冷冻（－196 ℃）两种。适用于细菌、真菌、 病毒等的保藏 • 液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下 进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒， 特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。 • 琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细 菌的保藏