抗原检测在侵袭性念珠菌病的诊断价值近年来由于造血干细胞，尸体器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物及广谱抗生素的应用，临床上侵袭性念珠菌感染（invasive candidiasis IC）在近20年呈明显上升趋势，约占医院感染中血源感染的8% ~10%，居院内血源性感染第4位【1】。
侵袭性念珠菌病病死率高达49%，占IFI总病死率的70% ~87%，为所有菌血症中病死率之首【2-3】。
白念珠菌是引起IC最常见的病原菌。
但是近年来由于对氟康唑的耐药，非白念珠菌（光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌）则较前增多,已占念珠菌病的50%以上,需要引起人们的重视。
但是由于IC的临床表现不典型，使得临床很难发现。
常见诊断侵袭性念珠菌病的标准实验室方法包括念珠菌直接镜检、念珠菌的培养和分离、组织病理学检查。
涂片染色镜检是最简单、最实用的实验室诊断方法,可作为感染的初筛方法。
如从无菌部位采集的标本中发现念珠菌即可确定感染。
但念珠菌血症的患者血培养50%呈阴性,血培养技术的改进使血培养的敏感性(最大能提高到70% )。
组织病理学检查虽然阳性率较高，,但多需要行创伤性操作,在患者病情危重时,常常会受到限制。
而且,这些方法用于诊断侵袭性念珠菌病缺乏足够的敏感性和特异性。
因此临床需要一种快速、特异和敏感地检测方法，近年来开展的真菌抗原检测，为实验室的早期、快速诊断提供了可能。
1．甘露聚糖在白念珠菌系统性感染的相关抗原中甘露聚糖是研究最早和最多的念珠菌细胞壁的主要表面抗原,它是由甘露糖和少量蛋白质组成的一种糖蛋白，系酵母菌细胞壁的成分之一。
酵母菌中导致侵袭性感染者主要为念珠菌，少数为新生隐球菌，而隐球菌的厚荚膜使细胞壁上的甘露聚糖难以释放入学，不易测得，所以血浆中甘露聚糖抗原，具有较高的属特异性,其基本化学结构是由D-葡萄糖和D-甘露糖通过β-1, 4糖苷键连接而成的多分支甘露糖多聚体,相对分子质量为110~220 kD左右的疏水性复合物。
其具有α-1-2糖苷键的己糖或庚糖部分被认为是抗原的决定簇。
不同的白念珠菌株中的血清学特性是由这些决定簇的不同长度决定的。
实验验证得出芽管是白念珠菌侵袭人体器官内皮和基膜过程中的重要物质之一【4】,体外实验又证实菌丝体的早期形式-芽管中甘露聚糖含量很高,与荧光染色的孢子或酶消化的孢子均不发生反应。
在白念珠菌感染的早期检测甘露聚糖有明确的辅助诊断意义。
甘露聚糖与细菌性抗原及类风湿因子等之无交叉免疫性,在发生IFI时血液中浓度极具升高。
Sendid等对甘露聚糖的检测发现,诊断侵袭性念珠菌感染的敏感度和特异性分别达到85%和90%,而曲霉菌感染、细菌感染和无感染组的检测结果均为阴性[5]。
由此看出,甘露聚糖检测提高了临床诊断侵袭性真菌感染的准确度,为及早应用抗真菌治疗挽救患者生命很有意义。
但是甘露聚糖抗原在血液循环中容易被快速清除,有报道,只有31% -90%的念珠菌血症患者会出现高甘露聚糖血症[6],单次样本的检出率不高,这与送检标本的频率、疾病病程、免疫抑制剂程度、感染的念珠菌种类等有密切关系,如进行多次连续的检测,效果更好。
甘露聚糖可用于快速诊断肺部侵袭性念珠菌感染的筛选试验,现在也可以用敏感性和特异性高的ELISA检测。
2.BGBG占真菌胞壁成分的50%以上,由D-葡聚糖聚合而成,以β-1, 3糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链,分支状β-1, 6糖苷键连接的葡萄糖残基作为侧链。
除结合菌(主要是根霉菌和毛霉菌)外,所有真菌胞壁成分中都含有BG,以酵母样真菌含量最高,而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含BG。
BG在真菌感染中的作用,可能与内毒素在革兰阴性杆菌感染中的作用类似,可刺激机体产生免疫反应,并被迅速清除。
当真菌进入血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞噬和消化等作用后, BG可从真菌细胞壁释放,从而使血液及其他体液(如尿液、脑脊液、腹水和胸水等)中的含量升高。
当真菌减少时,机体免疫系统将其迅速清除,而在浅部真菌感染时则无类似现象[7]。
因此血浆BG水平升高已成为IFI的一个重要指标。
20世纪90年代初发现,马蹄鲎(主要是东方鲎和美洲鲎)凝血系统中的凝血酶原G 因子能识别BG,是BG的天然检测者。
BG与G因子的α亚基特异性结合后可激活β亚基,从而旁路激活鲎实验(内毒素主要激活的是鲎的凝血酶原C因子)此过程即为G实验。
目前市场上常用的试剂盒主要有两种,日本的Fungitec-G glucan 试剂和美国的Glucatell试剂。
Fungitec-Gglucan试剂主要成分是东方鲎的细胞裂解产物,其判断标准为20 ng·L-1;而Glucatell试剂则使用了美洲鲎的细胞裂解产物作为主要原料,其判断标准的争议较多,目前推荐使用的判断标准为60 ng·L-1。
Obayashi等[8]研究G实验在真菌感染和真菌性发热中的诊断价值,检测了202例标本, 100例有明确感染菌的患者中, 37/41例(90% )确诊真菌感染患者中G实验阳性,59例其他原因所致的发热患者G实验均阴性; 26/102例不明原因发热患者G实验阳性;将阳性结果判断为真菌感染,则真菌感染判断的阳性率为59%,阴性率为97%,有效率为85%。
所有真菌定植患者血浆BG水平均无显著升高;所有确诊或高度可疑IFI患者在出现明显的临床症状前,至少有1次G实验为阳性,同时血清GM水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。
G实验可作为IFI的一种有效筛查方法,具有早期诊断价值。
目前主要用于侵袭性念珠菌、曲霉菌感染高危人群的监测及疗效和预后的评估。
其不足之处在于:①阳性结果只表示IFI,而不能确定是何种真菌;②不适用于结合菌和隐球菌感染的诊断,因根霉菌和毛霉菌胞壁中不含BG,隐球菌的胞壁中含量较少,且具有厚壁荚膜,不利于吞噬细胞的吞噬及抗原的释放[9, 10];③白蛋白、丙种球蛋白、香菇多糖、磺胺类药物及血液透析等均可导致假阳性结果。
由于BG也存在于植物胞壁中,故纤维素类物质的使用可导致假阳性结果(如手术中使用的纱布和血液透析时使用的某些纤维素制品)。
[11-13]3.烯醇化酶烯醇化酶属胞浆内酶类,又称2-磷酸-D甘油酯水解酶,由440个氨基酸组成,相对分子质量在45 kD~48 kD之间,是生物体内糖酵解途径中关键的胞内酶,具有高度的保守性。
烯醇化酶只有白念珠菌感染时才会大量释放,而寄生于浅表部的白念珠菌一般不会释放该酶,并可被患播散性念珠菌病的多数患者的血清抗体所识别,抗原有较高的属的特异性。
临床上用斑点免疫结合试验提高了试验的敏感性和特异性,可对有系统性念珠菌感染患者作出早期诊断。
在中性粒细胞减少患者中,系统性念珠菌感染的检出率为77%。
用多克隆兔抗念珠菌IgG为第一抗体,用羊抗兔IgG包被的胶体金颗粒为第二抗体检测念珠菌胞浆抗原,在具有侵袭性念珠菌病患者的19例中,16例检出抗原血症,而在其他各组对照人群中均未检出抗原血症,该试验的敏感性为84·2%。
用脂质体免疫试验(liposomal immunoassay)对具有组织学证据的侵袭性念珠菌病患者检测,敏感性为85%;血培养证明的念珠菌病患者,敏感性为64%。
一并考虑敏感性为75%、特异性为96%。
用胞浆抗原检测试剂盒(Directigen)检测48 kD蛋白抗原,得到相似结果。
总之大量的实验证明烯醇化酶是可明显刺激细胞和体液免疫反应的占免疫优势的免疫原,是反映白念珠菌系统性感染的一个敏感性的指标[14],因此烯醇化酶的检测在诊断白念珠菌系统性感染方面有较好的临床应用前景。
4.MP 65MP65是分子量为65kD 的甘露糖蛋白,它是白念珠菌细胞壁的组成成分,也可分泌至菌体外。
最近的一项研究利用抑制酶联免疫吸附法( inhibi-tion enzyme-linked immunosorbent assay)检测白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌小鼠念珠菌血症模型中产生的一种Mr65 000的蛋白质抗原[20]。
该抗原在小鼠感染模型中的血清浓度为0. 012~3. 25μg/ml。
对20位念珠菌血症患者的血清标本连续监测,结果80%患者抗原浓度为0. 07~5. 0μg/ml。
同时观察到念珠菌血症患者呈现三种不同抗原血症:完全清除、初始清除后复发、部分清除。
该研究表明检测Mr65 000分子有助于诊断上述3种念珠菌血症。
5.Cand-Tec抗原Cand-Tec抗原是指可采用念珠菌属检测系统(一种颗粒凝集试验系统)检测的一类念珠菌蛋白抗原,但文献报道的敏感度和特异度不尽相同,加之类风湿因子可导致假阳性结果,目前其临床应用价值有限。
小结随着IC的日益增多,临床上念珠菌感染的早期和特异性诊断显得愈加重要。
传统的真菌培养法耗时长,阳性率较低,但仍是IC诊断的金标准。
培养获得的病原体可以进行药敏检测,为临床治疗提供依据。
近年来迅速发展的血清学抗原检测,经过多中心的研究评价,有助于实验室诊断IFI和疗效监测。
但总体来说,不同的抗原检测缺乏大样本的临床研究，所以其研究结果之间存在较大的差异，我国部分教学医院已经开始应用这些血清学方法检测抗原诊断IC,但整体来说仍处于摸索阶段,短期内难以在临床检验工作中广泛开展。
因此，念珠菌抗原检测的临床应用价值应需要进一步评价。
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