高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
一. 实验目的
1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理
1、高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高
流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
2、在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流
动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
3、定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较
好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：
R＝ 2[t
(R2)-t
(R1)
] /1.7*(W
1
＋W
2
)
式中 t
(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t
(R1)
为相邻两峰中前一峰的保
留时间； W
1及W
2
为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大
于1.5。
4、本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增
塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件
液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂
1、仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂
甲醇（色谱专用），高纯水
四. 实验步骤
1、色谱条件
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）
柱温：室温
流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％
检测器：DAD检测器;
检测波长：220nm；
进样体积：100µl定量环，实际注射每次可控制在200µl。
2、待测溶液的配制
首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。
然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。
3、色谱测定
(1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent
1100在线工作软件，设定操作条件。
流量为1.000ml/min。
(2) 待仪器稳定后，开始进样。
将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器
吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至
“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。
(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。
(4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。
依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。
五.实验结果
（1）流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；
（2）流动相的比例为：高纯水：30% 甲醇：70%；流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；
（3）流动相的比例为：高纯水：20％，甲醇：80％，流速为0.5ml/min，记录色谱图，并计算分离度；
（4）定性过程（混合物和DBP）：实验得到如下的色谱图下：
六. 思考题
（1）比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。
但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？
图2 缓冲液作流动相得出的色谱图
图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图
答：因为缓冲液往往为酸碱盐溶液，而这种体系会导致固定相（如C8键合物质）的塌陷，失去作用。
尤其是纯的水和盐、酸、碱溶液长时间流过色谱柱可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的。
（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？
答：待测样品中可能会有颗粒物和杂质，色谱柱由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
对于仪器，溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
所以尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加
（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。
分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？
答：a.对于使用过缓冲液的柱子，必须先将体系中盐分去除干净，然后再以强溶剂清洗。
通常可以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20
倍柱体积，亦可直接以纯水洗至柱内无盐后再改换成强溶剂洗
脱。
要确保缓冲溶液与冲洗溶剂互溶。
如果不能互溶，首先要用
水含量相对较高的溶剂冲洗系统和色谱柱，然后再用冲洗溶剂替
换。
b.对于不用缓冲溶液：以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清
洗。
例如，90%~100%的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃等。
如果效
果不理想，则可换用更强的溶剂清洗，例如，将系统逐步置换至乙
酸乙酯、异丙醇、氯仿、烃类（如己烷、庚烷等）。
也可以在甲
醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用50%DMSO或DMF水溶液加以
清洗。
清洗几十倍柱体积后，再逐步置换返回原系统
（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影响及流速对分离度的影响。
答：见实验结果和分析。
水的比例增加会使得流动相极性增加，分离度增加，出峰时间增加。
而流速减小，分离度略有增加，出峰时间延长。