实验报告
4. 补体结合反应实验原理
补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。

参与本反应的五种成分可分为两个系统：
一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）；
另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。

待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。

若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。

再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。

5. 空斑形成实验
是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC)测定。

可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。

经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。

一个空斑即代表一个抗体形成细胞。

一、SRBC的制备
（一）无菌抽取绵羊血
1.手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。

2.抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血，摇晃时不能用力过猛，防止SRBC破裂。

（二）绵羊红细胞的制备
1.在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。

2.配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。

3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。

4.再次配平后，2000rpm离心10分钟，2-3次。

5.吸去上清液，获得绵羊红细胞。

（三）绵羊红细胞悬液制备
1.20%绵羊红细胞悬液制备
在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。

2.2%绵羊红细胞悬液制备
在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水加入锥形瓶，混合均匀。

二、溶血素的制备
（一）免疫接种程序
（二）免疫途径
在大白兔背部三个点酒精消毒后，皮下接种绵羊全血。

（三）试血
1.动物免疫18天后缘静脉采血2毫升，离心取血清。

2.清稀释成不同倍数补体溶血实验。

（四）心脏取血
胸骨左缘第3、4肋间心脏跳动最明显处。

手术剪去毛，消毒后注射器取20ml血。

（五）补体灭活与溶血素保存
1.将心脏血分别注入2支离心管中，各10ml。

2.配平，2000rpm离心10分钟，保留上清液，即血清。

3.将血清置于56℃恒温水浴锅30分钟，电动移液枪加入等体积甘油，记号笔标明：溶血素、日期、效价（1：6400）。

置于-20℃冰箱保存。

三、补体溶血实验
四、补体结合试验结果分析
补体结合实验阳性说明待测的Ag（或Ab)与已知的Ab（或Ag)是相对应的。

反应系统中形成的Ag-Ab复合物先结合补体，激活的补体被消耗，指示系统中已再无补体参与激活。

五、空斑形成实验
（一）免疫小鼠
将5%SRBC（0.4ml）注射于小鼠腹腔。

（二）脾细胞悬液的制备
1.免疫5天后，捉取小鼠，固定好。

2.小鼠腹部消毒后，用镊子提起皮肤，眼科剪剪开暴露腹白线，再剪开肌层暴露腹腔。

3.用滴管吸取Hank;s液于平皿，用镊子和眼科刀协助取出小鼠脾脏于平皿。

4.吸取Hank’s液于装有脾脏的平皿，镊子夹取200目细胞滤网于离心管口。

用眼科剪在脾脏两端剪开小口，再用研磨棒磨碎脾脏（在脾脏两端剪小口便于研磨出小鼠脾细胞，以减轻研磨对小鼠脾细胞的损伤）。

5.用滴管吸取肝脏研磨液，逐滴滴过200目细胞滤网于离心管，得到脾细胞悬液。

6.配平，1000rpm 4℃离心5分钟。

离心后洗2次，用Hank's液重悬脾细胞，计数调细胞浓度至2×107/ml。

（三）底层琼脂板的制备
1.再酒精灯周围，将加热的1.4%琼脂凝胶倒入平皿中约3ml，待凝胶凝固后倒扣，放入37℃恒温培养箱。

（四）顶层琼脂板的制备
1.在45℃恒温水浴锅中，在1ml的0.7%琼脂凝胶中依次加入0.5ml 5%SRBC悬液、0.5ml 107/ml脾细胞悬液、0.5ml 1 ：6补体。

2.将配比好的顶层琼脂迅速混匀倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，静置15分钟，再放入37℃恒温培养箱孵育1-1.5h。

若1和5不溶血，2-4溶血，则检验阳性，M是梅毒患者；若1-4溶血，5不溶血，则检验阴性，M不是梅毒患者。

二、注意事项
1.在无菌室中的实验步骤一定要严格操作，避免污染对实验的影响。

2.免疫接种时注意免疫间隔，以便产生更多抗体。

3.注意更换移液管枪头，以免造成污染，影响实验结果。