• 加入物质和如何添加仍然需要经验确定，有盲目性
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连续发酵的优点
• 操作条件的稳定有利于微生物的生长代谢，从而使 产率和产品质量也相应保持稳定 • 机械化和自动化能降低劳动强度 • 减少非生产占用时间，提高设备利用率 • 细胞生长状态一致，产物生产的持续性好 • 生产同样量产物所需生物反应器比分批发酵的小 • 测量仪器探头寿命延长 • 过程优化容易，有效提高发酵效率
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发酵工程的应用
• 现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵 生产，还包括微生物机能的利用
发酵法生产的物质
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发酵的基本过程
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菌种选育
• 发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、 发酵工艺和设备 • 菌种选育的目的是为了改良菌种的特性，使其符合 工业生产的需要
• 上世纪40年代，抗生素大规模深层发酵工艺建立
• 随着新型发酵设备、发酵工艺和育种技术的发展，现代发酵 工程达到了一个新的高度
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微 生 物 发 酵 的 历 史
ห้องสมุดไป่ตู้4/46
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发酵工程的内容
• 发酵工程由三部分组成：上游工程、发酵工程和下 游工程
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发酵工业回顾
• 几千年前，人类开始酿酒、制酱、制奶酪等
• 1675年，列文虎克发明了显微镜，观察到了微生物
• 巴斯德证明酒精发酵是由于酵母菌引起的，发酵现象是由微 生物所进行的化学反应
• 柯赫建立了单种微生物的分离和纯培养技术，新的发酵产品 不断出现，以固态发酵和浅层液态发酵为主
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代谢控制发酵
• 利用遗传学的 方法或其他生 物化学方法， 人为的在 DNA分子水 平上改变和控 制微生物的代 谢，使有用目 的产物大量生 成和积累
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微生物细胞氨基酸、核苷酸的调节机制
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酶 的 生 物 合 成 和 活 性 调 控
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污泥堆肥中的微生物相
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补料分批发酵的优势
• 解除营养基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解 阻遏效应 • 对于好氧发酵，避免在分批发酵中因一次性投入基 质过多而造成细胞大量生长，好氧过多，以致通风 搅拌设备不匹配的状况 • 某些情况下，还可以减少菌体生产量，提高产物的 转化率
• 与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题， 其适用范围也比连续发酵广
– 宇宙射线、短波辐射、诱变物质等 – 碱基的互变异构作用，造成配对错误
• 自然突变的几率大约是10-9～10-8 • 自然突变可能导致菌种退化或对生产有益的转化 • 效率较低，容易退化
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诱变育种
• 诱变育种是诱发突变与随机筛选相结合的一种育种 技术，是工业微生物育种中使用最多的菌种改良手 段 • 人为利用物理、化学因素，使诱变的细胞内遗传物 质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重 复等畸变，或DNA的某一部位发生改变（点突变）， 从而使微生物的遗传物质DNA或RNA的化学结构发 生变化，引起微生物的遗传变异 • 诱发突变的频率远大于自然突变
发 酵 罐 的 结 构
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发酵过程监测
• 物理参数
– 温度、压力、流量、转速、粘度、泡沫位等
• 化学参数
– pH、溶氧、尾气、发酵液成分、离子浓度等
• 生物参数
– 生物量、ATP、蛋白质等
• 在线与非在线测量
• 间接测量
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发酵与产物分离耦联技术
• 在反应过程中及时将产物或有害物质从反应系统中 移出，可以保证生化反应高效进行，简化下游处理
• 真空发酵：真空减压，易挥发组分分离，只适用于厌氧 发酵 • 气提发酵：氮气、氢气或二氧化碳作为气提载体，将发 酵蒸气压大于水的挥发性产物带出，主要用于厌氧发酵 • 吸附发酵：吸附剂回收产物或副产物，减少抑制 • 膜分离发酵：膜分离设备与发酵设备耦联，膜生物反应 器 • 萃取发酵：双水相萃取
• 生物反应器的基本类型
– 搅拌式生物反应器（stirred tank reactor） – 鼓泡塔式反应器（bubble column） – 气升式反应器（airlift reactor）
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几 种 常 见 的 生 物 反 应 器
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发酵过程优化及控制
• 建立发酵过程模型，实现过程优化控制
描述细胞群体的数学模型
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非结构模型
发酵过程参数之间的关系
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发酵过程控制
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下 游 处 理 流 程
– 上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件（pH、温度、 溶氧和营养组成）的确定、营养物的准备等 – 发酵工程主要指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养 细胞和生产代谢产物的工艺技术。要求严格的无菌生长环 境。可分为分批发酵，补料分批发酵和连续发酵 – 下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术。包括固液 分离技术，细胞破壁技术，蛋白质纯化技术，和产品的包 装处理技术。还要考虑发酵后的菌体与废物处理问题
• 制定筛选方案综合考虑出发菌株和诱变剂的选择， 并选择合适的诱变方法和剂量
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微 生 物 诱 变 育 种 流 程
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诱变育种的筛选
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初级代谢产物和次级代谢产物的比较
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dX X dt
max [S ]
Ks [ S ]
[ S1 ] [ S2 ] • 双基质限制生长动力学： max ( K [S ])( K [S ] ) s1 1 s2 2
• 基质抑制生长动力学：
max [ S ]
K s [ S ] [ S ]2 / Ki
– 提高其生产能力 – 能适应特定的工艺条件，如能利用廉价的原料、耐受性好
• 目前主要采用自然选育和诱变育种的方法，工作量 大，有一定盲目性 • 基因工程、细胞工程等育种方法具有定向性
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菌种分离、筛选的原则与步骤
• 菌种分离过程中需要考虑的主要因素
– – – – – 营养特性，能够利用廉价、来源丰富的原料 生长温度 遗传和生产能力的稳定性 转化能力和产物浓度高 易分离，本身无毒，也不产毒
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堆肥
• 依靠自然界广泛分布的细菌、真菌等微生物，有控 制的促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转 化的生物化学过程
– 好氧堆肥：发热阶段（中温微生物），高温阶段（好热纤 维素分解菌），降温和腐熟保肥阶段（中温微生物）；预 处理，一次发酵、二次发酵，后处理 – 厌氧堆肥：不设通气系统，温度低，腐熟及无害化所需时 间较长
固态发酵的优缺点
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固态发酵生物反应器类型
• 浅盘式生物反应器
• 填充床生物反应器
• 流化床生物反应器
• 转鼓式生物反应器
• 搅拌生物反应器
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浅盘生物反应器
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水平桨混合反应器
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细胞死亡动力学
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产物形成动力学
• L-P模型： d [ P]
dX k1 k2 X dt dt
– K1>0, K2=0时，为生长耦联型 – K1>0, K2>0时，为部分生长耦联型或混合型 – K1=0, K2>0时，为非生长耦联型
发酵动力学
• 细胞生长和死亡动力学
• 基质消耗动力学
• 氧消耗动力学
• CO2生成动力学
• 产物合成和降解动力学
• 代谢热生成动力学
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微生物生长动力学
微生物分批培养生长曲线
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Monod方程
• 对数期微生物增长： • Monod方程：
• 已应用于工业生产的有单细胞蛋白生产、废水生物处理等
• 固定化细胞技术与连续培养相结合，已应用于丙酮、丁酸、 异丙醇等重要工业溶剂
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发酵生物反应器
• 发酵罐是最重要的微生物细胞反应器
– – – – 染菌率低 大型化，有利于提高经济效益 过程优化可提高产量和降低成本 利于提高产品回收率和质量
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常用的诱变剂及其类型
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常 用 烷 化 剂 的 种 类
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诱变育种方案设计