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第21章基因诊断与基因治疗
建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法
1、限制性内切酶(restriction endonuclease) 酶谱分析法
2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分 析法
第21章基因诊断与基因治疗
•RFLP分析法
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第21章基因诊断与基因治疗
3、ASO杂交法
根据已知基因突变位点的核苷 酸序列，人工合成相应于正常和突 变基因碱基序列的两种寡核苷酸探 针，用它们分别与受检者DNA进行 分子杂交来检测是否存在等位基因 突变。
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第21章基因诊断与基因治疗
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第21章基因诊断与基因治疗
•﹣
•+
•正常人
•纯合突变 •杂合突变
•Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析 • （线粒体DNA第11778位G→A所致）
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第21章基因诊断与基因治疗
（三）、基因测序(gene sequencing)
即测定某一基因的碱基序列。
于支持物上，然后与待测的标记样品的基 因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光 聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并
配以计算机系统对每一探针上的荧光信号 作出比较和检测，从而迅速得出定性和定
量的结果。
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第21章基因诊断与基因治疗
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第21章基因诊断与基因治疗
基因芯片的应用
1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找
•normal •A G C T G T G C A A G T C G T G •gene •T C G A C A C G T T C A G C A C
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•Gene replacement
第21章基因诊断与基因治疗
3、基因增补 (gene augmentation)
将目的基因导入病变细胞或其他细 胞，不去除异常基因，而是通过目的基 因的非定点整合，使其表达产物弥补缺 陷基因的功能或使原有基因表达增强。
第21章基因诊断与基因治疗
2、DNA-RFLP分析法
中性突变是指在人基因组中，平均 每200对碱基可发生一对变异的现象。
DNA多态性是指中性突变导致个 体间核苷酸序列的差异。
限制性片段长度多态性是指DNA多 态性若发生在限制性内切酶识别位点 上，酶切水解该DNA片段就会产生长度 不同的片段。
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第21章基因诊断与基因治疗
•（二）、基因治疗的基本方法
• 1、基因矫正 (gene correction) • 2、基因置换 (gene replacement) • 3、基因增补 (gene augmentation) • 4、基因失活 (gene inactivation)
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第21章基因诊断与基因治疗
•abnormal•A G C T G T G T A A G T C G T G •gene •T C G A C A C A T T C A G C A C
•A G C T G T G C A A G T C G T G •normal •T C G A C A C G T T C A G C A C
核酸探针 是一类具有放射 性标记或化学标记的并与目的 目的DNA或RNA分子序列互补 的寡核苷酸片段。
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第21章基因诊断与基因治疗
探针是能够同某种待研究的核 酸序列或蛋白多肽链特异结合的任 何分子，经标记之后可用来检测目 的DNA/RNA 或蛋白质分子。
实验流程：提取DNA→(限制酶 切)→凝胶电泳→膜转移→杂交→放 射自显影→分析
•（二）、分类 • DNA诊断—以DNA为检测对象的诊断方法。 • RNA诊ຫໍສະໝຸດ —以mRNA为检测对象的诊断方法。
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第21章基因诊断与基因治疗
（三）、特点
n 针对性强 n 特异性高 n 灵敏度高 n 适用性强，诊断范围广
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第21章基因诊断与基因治疗
二、 基因诊断常用技术方法
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第21章基因诊断与基因治疗
简言之：DNA指纹或遗传指纹 是指采用“小卫星”基因探针进行 DNA分子杂交（ Southern 印迹， Southern blotting）所得的图谱。
实验流程：提取DNA→限制酶切→ 凝胶电泳→膜转移→杂交→放射自显 影→分析
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第21章基因诊断与基因治疗
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第21章基因诊断与基因治疗
3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法
n PCR-SSCP法* n PCR-ASO法 n PCR-RFLP法 n PCR-限制酶谱法 n PCR-STR（短串联重复序列，short
tandem repeat）
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第21章基因诊断与基因治疗
•单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
第21章基因诊断与基因治疗
1、基因矫正 (gene correction) 指将致病基因的异常碱基进行纠
正，而正常部分予以保留。
纳米钳
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第21章基因诊断与基因治疗
••••agngebeonnnreomermalal••AT
G C
C G
T A
G C
T A
G ••CT C ••GA
A T
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第21章基因诊断与基因治疗
•1、基本工作原理
•Template • 5 DNA
•5
• 5
•Cycle 1
•Primer 1 •5 •Primer 2
•5 • 5
•5 •5
•Cycle 2
•5 • 5
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•5
• 5
•5
• 5
•5 •5
第21章基因诊断与基因治疗
•5 • 5
第21章基因诊断与基因 治疗
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2020/11/25
第21章基因诊断与基因治疗
基因(gene)
基因是为生物活性产物编码的 DNA功能片断，这些产物主要是蛋 白质或各种RNA。
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第21章基因诊断与基因治疗
•基因变异致病类型
•内源基因的变异 • 基因结构突变 • 基因表达异常
三、基因诊断的应用
n 遗传疾病 n 肿瘤 n 感染性疾病 n 传染性流行病 n 判断个体疾病易感性 n 器官移植组织配型 n 法医学中个体识别、亲子鉴定
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第21章基因诊断与基因治疗
总结
基因诊断的概念、特点、常 用的技术方法及应用。
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第21章基因诊断与基因治疗
复习题
•1、名词解释： • 基因诊断、DNA诊断、RNA诊断、 •RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA 指纹 •2、简述基因诊断的特点、常用技术方 法及可用于诊断的疾病。简述基因变异 致病的类型及内源性基因变异的类型。 简述限制性内切酶谱分析法、ASO探针 杂交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、 DNA指纹等的实验流程。
•A G C T G T G C A A G T C G T G •normal •T C G A C A C G T T C A G C A C
•gene
•abnormal•A G C T G T G T A A G T C G T G •gene •T C G A C A C A T T C A G C A C
ASO杂交法
•﹣
•+
探针：M N M N M N M N 正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷 （新的突变类型？）
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第21章基因诊断与基因治疗
（二）、聚合酶链反应
(polymerase chain reaction, PCR)
是利用特异的引物，特异地扩 增目的DNA的方法。
实验流程：提取DNA→PCR→ 凝胶电泳→显色→分析
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第21章基因诊断与基因治疗
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第二节
基因治疗
Gene Therapy
第21章基因诊断与基因治疗
•一、基因治疗的概念
•（一）、基因治疗的概念
• 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组， 以校正和置换致病基因的一种治疗方法。
• 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转 移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以 达到治疗疾病目的的方法。
A T
G C
T A
C G
G C
T A
G C
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•Gene correction
第21章基因诊断与基因治疗
2、基因置换 (gene replacement)
指用正常的基因通过体内基因同源 重组，原位替换致病基因，使细胞内的 DNA完全恢复正常状态。
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第21章基因诊断与基因治疗
新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用
药物筛选、药物作用机制研究、耐药 菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化 学毒物的筛选、基因扫描等
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第21章基因诊断与基因治疗
（五）、DNA指纹(DNA fingerprint)
• 在人基因组DNA中有高度可变的“小卫 星”区域，采用“小卫星”基因探针，在同 一限制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个 体不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而 不同个体之间（同卵双生除外）谱带都不相 同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样， 因此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指 纹（genetic fingerprint）。