第九章 植物胚胎培养与离体受精
一 、什么是植物胚胎培养
? 胚胎培养（embryo culture ）是植物组 织培养的一个主要领域。植物胚胎培养 是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如 子房、胚珠）进行人工离体无菌培养， 使其发育成幼苗的技术。
? 从离体胚到完整的植株，其发育途径有3 条：1、正常胚胎发育途径 2、脱分化 形成愈伤组织 3、早熟萌发产生畸形苗
? 例2：伊华林等以柑橘异源四倍体杂种为 父本与单胚的二倍体柑橘类型杂交，通 过幼胚获得了三倍体植株。
– 2、获得单倍体和多倍体植株
– 例1：孙敬三等利用小麦 X玉米获得了小麦 单倍体。
? 例2：伊华林等以柑橘异源四倍体杂种为 父本与单胚的二倍体柑橘类型杂交，通 过幼胚获得了三倍体植株。
? 3、打破种子休眠，促进胚萌发
? 例：Arrillaga 等（1992）证明用各种方 法处理未经层积处理的花白蜡完整种子， 都不能明显提高种子的发芽率，但将种 子浸泡24h后，取出胚进行离体的胚培养， 胚萌发率高达90%以上。因此他们认为 离体胚培养可以解除种子休眠。
? 5、克服种子生活力低下和自然不育性， 提高种子发芽率
? 例：Musa balbisiana 是商品香蕉的1个 野生亲缘物种，其种子在自然条件下不 能萌发，然而通过离体胚的培养很容易 产生幼苗
? 2.配子之间是否有识别过程以至特异 ? 结合？
? 3.配子融合的动力学机制？
? 4.植物如何避免多精入卵问题？
? 5.受精对卵细胞的激活作用始自何时？ ? 通过何种机制？何种信号？
试管受精（test-tube fertilization）
将胚珠或子房在离体培养的条件下进行授粉和 受精的方法。（ 60年代）
IVF的研究意义
1. 为受精生物学的重要理论问题的探索与解决 开辟了新的途径；
2. 用于遗传育种中可以克服自交不亲和性，进 行作物改良。
离体受精所能克服的是那些以花粉 —柱头或花粉 — 花柱相互作用为基础的不亲和障碍，并不是万能的。
中央细胞和精细胞的融合及发育
当前热点问题
利用离体受精系统研究受精与早期胚胎发生过程 中的基因表达，是本领域研究由细胞水平进入分 子水平的新趋势，主要工作是
4. 核融合——融合过程中的信号问题
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞
4. 核融合——融合过程中的信号问题
核融合一般在精—卵融合后35-90min 出现 。烟草卵细胞 有明显的极性即液泡端和胞质端，但无论精子在卵细胞 哪一端融合，卵细胞质都可很快地移向精核处将其纳入 并包被。
Feeder Cell:
未成熟胚悬浮细胞或小孢子细胞
Feeder Cell促进被饲养物生长的原因：
1）增加细胞密度 2）细胞旺盛分裂或分化过程中产生活性物质
——生长促进因子 (GPF) （维持细胞分裂、生长和发育所必需的）
从离体受精到植株开花约 需100天，形成的籽粒具 有正常发育的胚和胚乳。
目前，唯一一例离体融 合产生的合子培养获得再 生可育植株是在 玉米中实 现的。
3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨
3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞
体内自然受精过程中，至少部分被子植物的精细胞质未 能进入卵细胞；而在离体受精时，精细胞质则 全部进入 卵细胞 。
三 、植物胚胎培养的内容
1、胚培养 （1）成熟胚培养 （2）幼胚培养 2、胚珠培养 3、子房培养 4、胚乳培养 5、植物离体受精
三 、植物胚胎培养的内容
1、胚培养 （1）成熟胚培养 （2）幼胚培养 2、胚珠培养 3、子房培养 4、胚乳培养 5、植物离体受精
? 1.来自同一花粉管的两个精子是定向 ? 还是随机运动到卵细胞或中央细胞？
离体受精的技术基础 （二）
2. 单对配子融合
1) 微电融合
85%融合率，只有此法融合的产物再生了植株。
2) 高钙—低PH介导融合
电融合方法的代替技术。
3) 一般钙条件融合 4) PEG诱导的融合
离体受精的技术基础 （三）
3. 人工合子的培养
培养方法 ——目前常采用 微室饲养 培养 将商品通过室底部微孔滤膜吸取周围 饲 养细胞 释放的活性物质，促进其发育。
离体受精（IVF）
指在离体环境中完成 被子植物的精、卵融合 而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植 株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条 件下完成。（ 90年代）
离体受精的技术基础 （一）
1.配子分离
1) 卵细胞的分离
a. 酶学的方法 b. 直接解剖法
2) 精细胞的分离
a. 渗透压冲击法 b. 机械分离法
IVF的研究意义
1. 为受精生物学的重要理论问题的探索 与解决开辟了新的途径；
2. 用于遗传育种中可以克服自交不亲和 性，进行作物改良。
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用
利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征，如表面膜蛋白 特别是糖蛋白的分布等直接进行分析，这可以帮助判断 糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是 配子识别必不可少的；
二 、植物胚胎培养的意义
? 1、克服杂种胚的败育，获得稀有杂种 ? 例：程桂琴等（2000）通过离体胚培养
成功地获得了纤毛鹅观草和5个四倍体小 麦种（品种）的属间杂种植株及愈伤组 织，有效地克服了纤毛鹅观草和四倍体 小麦杂种胚发育小的问题。
– 2、获得单倍体和多倍体植株
– 例1：孙敬三等利用小麦 X玉米获得了小麦 单倍体。
2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用
2. 膜融合——多精入卵问题的探讨
膜融合的方式，在不同的离体受精系统中融合的原理是 不同的，一种是精细胞质很快进入卵细胞，精细胞膜作 为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。另一种是 精细胞整体进入卵细胞，精细胞膜并不参与融合产物细 胞膜的形成。