Western Blot
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可 以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级 和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫
键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链 形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。

Western Blot
Western Blot结果分析

目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正 误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对 含量。 Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）
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蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
• 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； • 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；
• 产物：三维网状结构凝胶
• 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals) 的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来
完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化


确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温
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转移到膜上的蛋白很少 原 因 蛋白分子量< 10KD
蛋白的等电点< 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑” 条带？
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转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
条带歪斜或漂移？
单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？

电转仪长期使用导致海绵变薄，“三
明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
Western Blot
灌制积层胶
插入梳子
Western Blot
Staking gel
Separating gel
Western Blot
转膜

要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。
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不连续电泳：
作用
浓缩胶 分离胶 使蛋白样品浓缩 使蛋白样品分离
缓冲液PH
pH6.8TrisCl pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5% 高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%

有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，
包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
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蛋白样品的定量

目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
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杂交信号很弱
原 因 抗体保存不当
抗原不充足 膜的漂洗过度
1.
1. 2. 3.
对 策
2.
3.
抗体长期保存应在－70℃ ，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知 标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数
Western Blot
出现非特异带
原因
1.
2.
一抗不是唯一特 异的 二抗出现非特异 结合
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O

DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。

按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
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SDS-PAGE电泳

凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，
简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网
状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明
度。是良好的电泳介质。
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聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：
• 单体：丙烯酰胺（Acr）；
• 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC
膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，
对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。
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二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
Western Blot
膜解吸方法（膜的重复利用）

通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离， 适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位 点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任 何化学发光底物系统。
（核黄素——TMTED）体系。
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凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％）
15
线性分离范围（KD)
12-43
10
7.5 5.0
16-68
36-94 57-212
SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：/thread-20726-1-1.html
/bio101/2008/21461_2.htm


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湿转系统
Western Blot
半干转移系统
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转膜后检测（此步可以省略）
丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。
蛋白质免疫印迹技术及
常见问题分析
张绍进
Western Blot

Western Blot简介

Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

Western Blot
Western Blot 简介：

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
Western Blot
一抗、二抗孵育

把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4℃过夜。

回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。
加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4℃过夜。

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Western Blot常见问题分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净


加入AP和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混合，防 止部分胶块聚合不均匀


温度合适，受热不均匀导致胶聚合不
均匀 两块玻璃板底部要对齐

蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
/thread-23639-1-1.html
Western Blot
蛋白样品的变性

2×SDS-PAGE上样缓冲液：
1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT SDS 甘油 溴酚蓝 总体积 10 ml 20 ml 4g 20 ml 0.2 g 100ml