实验四细菌的芽孢染色
生物112 周泓兆1102040226
一、目的
学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。

二、原理
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。

芽孢具有厚而致密的壁，因此想要将芽孢染色需要在较高的温度（煮沸）的条件下，用强染色剂（孔雀绿）将菌体和芽孢同时染色。

而同时，实验利用了孔雀绿可经水洗脱色的特点，通过水洗将菌体的着色洗脱，而芽孢因具有致密的壁而不会被水将染色洗脱。

接下来用番红染色，将菌体染为红色，而在常温下品红无法将芽孢着色，因此在显微镜下形成了芽孢为绿色而菌体为红色的现象。

而实验中如果要观察芽孢在菌体中的着生位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。

三、材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26℃-28℃，培养2-3天。

2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液。

3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，酒精棉球，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种环，酒精灯，镊子。

四、实验步骤
1.制片：将枯草芽孢杆菌涂片并干燥固定。

2.染色：撕取一块比载玻片略窄的吸水纸，覆盖在涂片出，在吸水纸上滴加孔雀绿直至饱和。

用酒精灯加热是染液保持微沸，其间不断添加适量孔雀绿染液，保持吸水纸湿润，染色5min。

3.水洗：待玻片冷却后，用镊子出去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

4.复染：用番红染液染色1-2分钟，水洗。

5.镜检：涂片干燥后，滴加香柏油置于油镜下观察。

6.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片放入废片缸，将固体垃圾放入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。

五、结果与讨论：
这个实验成功率很高，主要原因是步骤简单，染色效果明显而且影响因素少，洗脱时间对结果影响要比革兰氏染色中酒精脱色时间的影响小很多。

最后结果的小遗憾是孔雀绿绿色的着色较浅，我觉得可以通过适当增加涂片的菌体密度和增加染液煮沸时间，可能会获得更好地效果。

六、思考题：
1.为什么在孔雀绿加热染色时，要待玻片冷却后才能冲洗？
答：我推测的原因如下：①菌体在突然遇冷之后会变形甚至破裂，影响观察。

②在沸腾的情况下染料能更方便地进入芽孢，那么高温下染料也应该更容易从芽孢中被洗出，所以等到冷却使得孔雀绿尽可能留在芽孢内。

③防止载玻片在高温下突然遇冷而炸裂。

2.分别从菌龄、制片等方面，简述细菌芽孢染色需要注意的技术要领。

答：应当选取适宜菌龄的细菌来制作做涂片，菌龄过小还没有形成芽孢，菌龄过大则会有好多菌体破裂无法看到芽孢的着生位置；制片过程中则需要注意染色时间的控制，不可过长（使得染色过深无法用水脱色影响观察）或过短（使得染色过浅无法观察到芽孢），还要控制温度不能过高，免得菌体、芽孢囊破裂或染液在载玻片大量沉积影响观察。

最后要在冷却后用水冲洗，不能直接用水冲洗热的载玻片。