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第１　页 共　７　页　& 项目八：常用培养基制备　学习目标　能力目标：会进行常用细菌培养基的配制；会正确矫正培养基ｐＨ值；会对物品进行常规消毒和灭菌。　知识目标：明确常用培养基制备原理、种类及其用途；知道常用培养基制备程序；知道常用消毒、灭菌的方法。　态度目标：严格按照操作规程进行操作，养成良好的习惯；严格无菌操作，注意生物安全；配制培养基时准确称量，认真操作。　

一、知识链接　培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。细菌生长繁殖需要一定的营养物质，不同的细菌对营养的要求不同，但细菌生长需要的营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类、生长因子和水等。　（一）培养基的种类与用途　１．根据培养基的物理性状分类　（１）液体培养基：呈液体状态的培养基为液体培养基。在实验室中主要用于微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体，在发酵生产中绝大多数发酵都采用液体培养基。　（２）固体培养基：呈固体状态的培养基都称为固体培养基。常用的固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂（约２％的琼脂或５％～１２％的明胶），加热至１００℃，然后再冷却凝固而成的。固体培养基主要用于菌种分离、鉴定、菌落计数、抗菌药物敏感试验等。　（３）半固体培养基：半固体培养基是指在液体培养基中加入少量凝固剂（如０．２％～０．５％的琼脂）而制成，可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力、厌氧菌的培养及菌种保藏等。　２．根据培养基的功能分类　（１）基础培养基：含有微生物需要的最基本营养成分，可供大多数微生物生长。　（２）营养培养基：在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细菌生长，如血平板、血清肉汤等。　（３）选择性培养基：是利用不同种类细菌对各种化学物质的敏感性不同，制成有利于选择欲分离的细菌而抑制其它细菌生长的培养基。如在培养基中加胆酸盐能抑制革兰氏阳性菌的生长，有《微生物检验技术》精品资源共享课程　　

第２　页 共　７　页　利于革兰氏阴性的肠道致病菌生长。　（４）鉴别培养基：供细菌生化反应试验，借以鉴定细菌之用。如在无糖基础培养基中加入乳糖和ｐＨ指示剂，接种细菌后培养，如细菌能分解乳糖产酸，则指示剂变色，不分解乳糖则颜色不变。如双糖或三糖铁培养基。　（５）厌氧培养基：专性厌氧菌须在无氧条件中才生长。进行厌氧培养的方法，一是将培养基放在无氧环境中培养；另一个办法是在培养基中加入还原性物质，降低培养基的氧化还原电势，并在培养基表面上用凡士林或石蜡封闭，使培养基与外界空气隔绝，让培养基本身成为无氧的环境。如庖肉培养基。　（二）培养基的制备程序　 配制一般培养基的主要程序可分为调配、溶化、矫正ｐＨ值、澄清过滤、分装、灭菌及检定等步骤。　１．调配 按培养基处方准确称取各成分，混悬于蒸馏水中。先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入蛋白胨、琼脂等各种固体成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。　２．溶化 将各种成分混匀于水中，加热溶解，溶化完毕后，应注意补足失去的水分。　３．矫正ｐＨ值 应用酸度计准确可靠，但常用的是比色法或ｐＨ试纸。一般细菌培养基须矫正ｐＨ至７．４～７．６，此外亦有需要酸性或碱性的培养基。培养基在高压灭菌后，其ｐＨ值约降低０．１～０．２，故矫正时应比实际需要的ｐＨ值高０．１～０．２。　４．澄清过滤 培养基配成后一般都有沉渣或混浊，需过滤澄清使其清晰透明方可使用，液体培养基常用滤纸过滤，固体培养基（琼脂培养基）可在加热融化后需趁热以纱布或两层纱布中夹脱脂棉过滤。　５．分装 根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管内。分装的量不能超过容器的２／３，以免灭菌时外溢。琼脂斜面分装量为试管容量的１／４～１／３，灭菌后须趁热放制成斜面，斜面长度约为试管长度的２／３。半固体斜面分装量为试管长度的１／３，灭菌后趁热直立，待冷后凝固。高层琼脂分装量约为试管长度的１／３。灭菌后直立凝固待用。如高层琼脂斜面灭菌后略放斜，使之既有高层又有斜面。琼脂平板须将灭菌（或已灭菌好加热融化）后的培养基冷至５０℃左右，以无菌方式倾入灭菌平皿内，内径９ｃｍ的平皿倾注培养基约１３～１５ｍｌ，轻摇平皿底，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后即成。　６．灭菌 不同成分、不同性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。①高压蒸气灭菌法：一般培养基高压灭菌１０３．４３ｋＰａ，　１２１℃，１５～２０分钟即可；含糖的培养基高压灭菌５５ｋＰａ　，１１３℃，１５分钟，以免糖类被破坏。②流通蒸气灭菌法：凡不耐高热的物质，如糖类、明胶、血清等培养基的灭《微生物检验技术》精品资源共享课程　　

第３　页 共　７　页　菌，可用流通蒸气灭菌，使温度达８０～１００℃之间，维持３０分钟，每天一次，连续３天。③血清凝固器灭菌：含血清、鸡蛋的培养基，可应用血清凝固器进行间歇灭菌。④滤过除菌法，可用于糖溶液、尿素液、血清等因加热即破坏的物质，可用滤菌器过滤除菌。　７．检定 每批培养基制成后须经检定后方可使用，检定时将培养基置３５℃温箱内培养２４小时后，看是否有细菌生长，以此来证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上的生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。　８．保存 制好的培养基，不宜保存过久，以少量、勤做为宜。每批应注明制作日期。平日少量分装的试管培养基均宜存放于４℃冰箱内，其他基础培养基等可保存于冷暗处。　

二、技能训练　（一）训练目的　１．掌握培养基制备的基本过程。　２．熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。　（二）材料准备　１．试剂 基础培养基干粉、营养培养基干粉、半固体培养基干粉、ＳＳ（沙门氏菌－志贺氏菌琼脂）培养基干粉、麦康凯培养基干粉、脱纤维羊血。　２．器材及其他 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、ｐＨ试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。　（三）训练内容 １．培养基制备的基本过程　（１）称量：按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、ＮａＣｌ放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。　（２）溶化：在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后加热使其溶解。待完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化培养基中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂，最后补足所失的水分。 （３）调ｐＨ：在未调ｐＨ前，先用精密ｐＨ试纸测量培养基的原始ｐＨ值，如果ｐＨ偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ，边加边搅拌，并随时用ｐＨ试纸测其ｐＨ值，直至ｐＨ达７．６。反之，则用１ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌ进行调节。注意ｐＨ值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求ｐＨ值较精确的微生物，其ｐＨ值的调节可用酸度计进行。　《微生物检验技术》精品资源共享课程　　

第４　页 共　７　页　（４）分装：①液体分装高度以试管高度的１／４左右为宜。②固体分装试管，其装量不超过管高的１／３，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。③半固体分装试管一般以试管高度的１／３为宜，灭菌后垂直待凝。　（５）加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。　（６）包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。　（７）灭菌：将上述培养基以１０３．４３ｋＰａ，１２１．３℃，２０分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。　（８）搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至５０℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。　（９）无菌检查：将灭菌的培养基放入３５℃的温室中培养２４～４８小时，以检查灭菌是否彻底。　２．常用培养基的配制　（１）肉汤：在大容量三角烧瓶中，加定量蒸馏水，按培养基制备说明书准确称量所需干粉，使其成分混合。待充分溶解后，分装于小容量三角烧瓶或试管内，加塞包扎后１０３．４３ｋＰａ高压蒸汽灭菌２０分钟。冷却后放阴暗处或４℃保存备用。该培养基一般供作无糖基础培养基，适用于营养要求一般的细菌。　（２）营养琼脂（普通琼脂）：在大容量三角烧瓶中，加定量蒸馏水，按培养基制备说明书准确称量所需干粉，使其成分混合。待充分溶解后，分装于小容量三角烧瓶或试管内，加塞包扎后１０３．４３ｋＰａ高压蒸汽灭菌２０分钟。若制作琼脂斜面培养基，取出试管后摆成斜面，待凝固后即成琼脂斜面。烧瓶中的琼脂温度降至５０℃左右倾注无菌平皿，凝固后即成营养琼脂平板。该培养基适用于营养要求一般的细菌，也可做无糖基础培养基使用。　（３）半固体培养基：在大容量三角烧瓶中，加定量蒸馏水，按培养基制备说明书准确称量所需干粉，使其成分混合。待充分溶解后，分装入小试管，每管２　ｍｌ，１０３．４３ｋＰａ高压蒸汽灭菌２０分钟。待取出后直立凝固即成。此培养基可用于保存菌种和观察细菌动力用。　（４）血液和巧克力琼脂培养基：将灭菌后的普通琼脂培养基加热融化，冷却至５０℃左右，以无菌操作加入１０％无菌脱纤维羊血（临用前需置３７℃水浴预温３０分钟），轻轻摇匀（避免产生气泡），分装于无菌试管或无菌平皿内，凝固后即成血液琼脂斜面或血液琼脂平板。若琼脂温度在７０～８０℃时加入羊血，并在８０℃水浴中摇匀１５～２０分钟，倾注平板凝固后即成巧克力琼脂平板。主要用