镜观察
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举例：过氧化物酶 peroxidase ,(POX) 1.原理
血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者 可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。 2.正常阳性细胞: ①. 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 ②. 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。 ③. 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。
› 转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。
› 在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现 上调细胞中的目的基因表达。
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（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要 方式
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› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋 白之间的相互作用。
› 原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射 光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用， 实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁， 通过荧光显微镜可以观察到这种改变。
› 特点：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光 光谱与受体的激发光谱要重叠。
› 缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两 个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需 要用免疫共沉淀进行验证。
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› （三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 › 被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛
›
光或改变本身荧光的发射波长与强度，从
而
›
通过荧光检测可以显示该离子的量。
› 应用：细胞内离子的实时检测 。
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› (二）绿色荧光蛋白（GFP)
› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋白之间的相互作用。
› 原理：构建荧光蛋白基因与目的蛋白基因的融合基因表达载体，转染特定细 胞，可以在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察目的蛋白在细胞内的位置及随 时间变化情况。
› 反应体系：
➢ 模板DNA； ➢ 耐热的DNA聚合酶； ➢ 引物； ➢ 4种脱氧核苷酸（dNTP）； ➢ 反应缓冲液。
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› 实时荧光定量PCR技术 › 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR
进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
› 反应步骤：
› Mullis要合成DNA引物来进行测序 工作，却常为没有足够多的模板 DNA而烦恼。1983年4月的一个星 期五晚上，他开车去乡下别墅的路 上,猛然闪现出“多聚酶链式反应” 的想法。
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› 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：是在体外对 特定的DNA序列进行的重复性复制反应（扩增）。
› 特点：融合蛋白不影响目的蛋白的真实定位，荧光蛋白仅仅是一个和标记物。
› 缺点：无法对几种蛋白质检的相互作用提供直接证据。
› 其他荧光蛋白：黄色荧光蛋白（YGP)、蓝色荧光蛋白（BGP)、青色荧光蛋白 （CGP)等
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› （三) 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）
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酶标抗体
RNA 探针
标记物
U AG
UC G
G G
U
C
AUC
C C AG
AUC
G
C
G
C UA
待测 mRNA
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原位杂交原理
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› （三）荧光实时定量PCR （Real-time PCR）
› 检测基因表达表达的常规方法
› 1985年，Kary Mullis在Cetus公司 工作期间，发明了PCR。1993年获 得了诺贝尔化学奖。
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› 三、 蛋白质相互作用的研究技术 › 研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。 › （一）免疫沉淀 › 偶联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞裂解液
或表达上清中相应的蛋白结合沉淀出来，在此过程中能够 与目的蛋白发生相互作用的蛋白被同时沉淀下来，利用 SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱等技术队沉淀中的蛋白 进行鉴定。 › 缺点：无法动态检测，存在假阳性。 › 应用：验证蛋白-蛋白的相互作用。
医学细胞生物学（第5版）
第三章 细胞生物学的研究方法
› 上次课 › 第一节 显微镜技术
› 第二节 细胞的分离培养
› 第三节 细胞组分的分离和培养
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本次课主要内容
› 第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术 › 第五节 细胞功能基因组学研究技术 › 第六节 生物大分子的结构测定
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选蛋白在噬菌体的表面进行表达；将目的蛋白固定在平结合的噬菌体，噬菌体扩增，多次重复上述分离过程富集特 异性结合的噬菌体，基因测序得到基因编码蛋白。
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› 四 蛋白质与核酸相互作用的研究技术
› 蛋白质与核酸（DNA和RNA）的相互作用是基因 表达调控的基础。蛋白质与基因组DNA相互作用 参与基因转录水平的调控、蛋白质（RNA结合蛋 白，RBP)与RNA特性结合完成转录水平和翻译水 平的RNA加工、修饰、转运、定位和降解等过程。
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› （一）染色质免疫沉淀技术研究DNA和蛋白质的相互作用 › 染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称
ChIP）原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起， 通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识 别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。交联反应的逆转 和DNA的纯化，DNA的鉴定。
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中性粒细胞呈 粗颗粒强阳性
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单核细胞呈 弥散弱阳性
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› 二、免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）
› 利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性 的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细 胞中相应抗原的方法。
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宫颈鳞癌细胞的免疫组化染色
显示NRDRB1蛋白在宫颈鳞癌组织中有特异表达，棕色为阳性表达。
› 常见的FRET荧光染料Cy3-Cy5；Alexa546-Alexa647； Texas Red-Tetramethylrhodamine等。
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› （四）单分子示踪
› 单分子荧光成像 › 优势：样品激发范围小，光子收集效率高，高量子产能高信噪比荧光基团及低成本荧
光。 › 应用：配体与受体地 结合、蛋白质的集合和解释，蛋白、mRNA等生物大分子的动力
公司名称
（二）RNA干扰技术 是下调基因表达的常 用方法
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异 性降解来高效、特异的阻断体 内特定基因表达，诱使细胞表 现出特定基因缺失的表型，从 而使基因转录后沉默的一种现 象。
› 染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉 淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。
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38公司名称ຫໍສະໝຸດ yy39公司名称
› （二）紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互 作用
› 应有：在全基因组水平揭示RNA和RBP相互作用。
› 原理：用254nm紫外光照射使细胞中的RNA分子与RNA结合蛋白发生共价结 合，以RBP的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀后，回收其中的RNA片段， 经过逆转录后对RNA分子测序，进而发现RNA与RBP之间的相互关系。应有 限制性酶切位点和识别序列的引物进行逆转录，可使CLIP分辨率达到单个碱 基水平，即iCLIP。
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› 一，基因表达的定量分析
› （一）印迹杂交技术
› 定量检测基因表达变化的基本方法 › Northern blotting › 检测特异性mRNA的技术，变性处理（甲醛、戊二醛）。 › Westen Blotting › 检测蛋白质分子，可检测同一蛋白质不同修饰方法，如磷酸化、甲基
– (1) 95℃变性：DNA双链解离； – (2) 55℃退火：DNA链与引物互补结合；
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– (3) 72℃延伸：DNA聚合酶作用下的互补链合成。
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› 二、 基因表达的上调和下调技术 › 基因克隆：指cDNA克隆，即将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应
得到的基因片段，插入到能进行自我复制的载体（通常是质粒），实现在受体细菌内 大量扩增的过程。
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› 一、酶细胞化学技术 通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的
分布及酶活性强弱的一种技术。
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光镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→ 冷冻切 片 → 细胞化学反应
（酶反应＋捕捉反应）→ 光镜观察 电镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→切组织片
→细胞化学反应 （酶反应＋捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电
› 缺点：交联效率低，难以区别结合和非结合RNA序列，254nm可诱发细胞 DNA损伤并结合新的RBP。